תודה לתמר, מיכל, מירה, שני, גלעד, יואה, שי,

זיהוי אתר הכרת הסובסטרט של אנטיקודון נוקלאז חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה " מאת רוברטו מיידלר הוגש לסנאט אוניברסיטת תל-אביב תשרי תשס "ב

עבודה זו נעשתה בהדרכת פרופסור גבריאל קאופמן

באהבה להורי היקרים

תודתי העמוקה לפרופ' גבי קאופמן על ההנחיה, התמיכה וחדוות המדע יוצאת הדופן. הנך עבורי מורה במובן הרחב של המילה. תודה לתמר, מיכל, מירה, שני, גלעד, יואה, שי, רחל, מיכל פ., אילן ולשאר חברי במעבדה ובמחלקה על העזרה ועל האוירה המצוינת. נהנתי לעבוד במחיצתכם.

עניינים תוכן 1 תקציר 4 מבוא. 1 4 מערכות התאבדות בקטריאליות כאמצעי הגנה אנטי ויראלי 1.1 5 גילוי האק "נ 1.2 5 מנגנון הגבלת - prr אק "נ 1.3 6 ביקוע ותיקון ה - trna Lys מסלול שחבור RNA נטול אינטרון 1.4 7 הלוקוס prr מקודד לאק"נ הלטנטי 1.5 8 מערכות רסטריקציה מודיפיקציה מטיפוס (Hsd) I 1.6 8 מקורה של מערכת prr באלמנט גנטי נייד שהתאזרח בכרומוזום ה.E coli 1.7 9 Stp גורם T4 המשפעל את האק"נ הלטנטי 1.8 10 PrrC אחראי לפעילות האק "נ 1.9 10 PrrC הינו בלתי יציב 1.10 11 חלוקה מבנית-פונקציונלית משוערת של PrrC 1.11 12 PrrC שונה מריבונוקלאזות קלאסיות 1.12 13 אופן הכרת הסובטראט ע "י PrrC 1.13 14 מטרות העבודה וממצאים עיקריים 15 ושיטות חומרים. 2 15 חומרים 2.1 15 גזעי חיידקים 2.2 15 רשימת פלסמידים 2.3 16 רשימת אוליגונוקלאוטידים 2.4 16 שיטות 2.5 16 מבדק אק "נ in vivo 2.5.1 17 מבדק אק "נ in vivo שלאחריו סימון קצה in vitro בעזרת פולינוקלאוטיד קינאז 2.5.2 17 מבדק אק "נ in vitro 2.5.3 18 יצירת ספריות מוטציות אקראיות 2.5.4 19 יצירת מוטנטי חסר 2.5.5 19 יצירת חלבון איחוי MBP-PrrC 2.5.6 20 שיבוט ההומולוג של PrrC מ N.meningitidis-MC58 ב E. coli 2.5.7 20 יצירת מוטציות מוכוונות בעמדות 286-288 2.5.8 20 סלקציה לאבדן רעילות תלויית אק "נ 2.5.9 21 זיהוי סוגי trna הנבקעים ע"י אק "נ 2.5.10 22 מיצוי פרגמנטי trna מג'ל פוליאקרילאמיד 2.5.11 22 זיהוי קבוצות קצה `5 של מקטעי RNA תוצרי האק "נ 2.5.12 23 עיבוד נתונים ממוחשב 2.5.13 23 שיטות כלליות 2.6 23 אלקטרופורזת גל 2.6.1 24 Western Blotting 2.6.2 24 PCR 2.6.3 25 קביעת רצף RNA 2.6.4 25 הפרדת מקטעי DNA על גל אגרוז והפקתם מהגל 2.6.5 25 טרנספורמציה לתאי E. coli 2.6.6 25 קביעת רצף DNA 2.6.7

25 רשימת בופרים 2.7 26 רשימת מצעי גידול לחיידקים 2.8 27 תוצאות. 3 27 זיהוי אתר PrrC המעורב בהכרת האנטיקודון של trna Lys 3.1 27 מוטגנזת חסרים 3.1.1 28 מוטגנזה איזורית וסלקציה לפגיעה בפעילות אק "נ 3.1.2 29 זיהוי צבר מוטציות הפוגעות בפעילות האק "נ 3.1.3 33 ביטוי ביתר של PrrC גורם לביקוע סוגי trna נוספים 3.1.4 37 שתי מוטציות סמוכות משנות מהותית את סגוליות החיתוך של אק "נ 3.1.5 41 מוטגנזה מוכוונת של האתר המשוער של הכרות הסובסטראט 3.2 41 פנוטיפ החיתוך של מוטציות בעמדה 287 3.2.1 44 פנוטיפ החיתוך של מוטציות בעמדות 286,288 3.2.2 46 אנליזת מוטציות של אזורי PrrC נוספים 3.3 50 זיהוי חלבונים הומולוגיים ל PrrC במאגרי נתונים 3.4 50 העדר פעילות אק "נ נצפית של הומולוג PrrC מ-.N meningitidis המבוטא ב-.E coli 3.4.1 53 Multiple sequence alignment 3.4.2 55 השוואת רצף אתר prr בכללותו עם האתרים ההומולוגיים 3.4.3 58 הארגון הפונקציונלי של PrrC 3.5 58 מוטיב DA box-like 3.5.1 59 התפלגות אחוז ה G+C בגן prrc 3.5.2 60 השוואת הרצפים ההומולוגים מציעה קיום אלמנט ב PrrC החורג מהמבנה היסודי 3.5.3 62 חקרית המבנה הרביעוני של PrrC בעזרת צילוב חלבון חלבון 3.6 64 דיון. 4 64 זיהוי ואפיון של אתר PrrC המעורב בהכרת הסובסטרט 4.1 67 רצף האנטיקודון של trna Lys כאלמנט הכרות של האק "נ 4.2 68 זיקות ידועות של RNA -חלבון כמודלים למנגנון בו אק"נ מכיר את הסובסטרט 4.3 71 כיצד נבקע trna Lys ע"י אק"נ? 4.4 72 ארגון פונקציונלי של PrrC 4.5 73 מבנה רביעוני 4.5.1 73 קישור ATP עשוי ליצב קונפורמציה של PrrC חיונית לפעילות הליבה 4.5.2 75 אילו חלקים של PrrC אחראים לאינטראקציה עם? EcoprrI 4.5.3 76 ניתוח יחסי מבנה-תפקוד על סמך השוואה ל PrrC הומולוגיים 4.6 77 כיצד PrrC השתבץ באתר? EcoPrrI 4.6.1 78 סיכום ביבליוגרפית 79 רשימה פרסומים 86 רשימת באנגלית תקציר I

קיצורים רשימת אק"נ אנטיקודון נוקלאז ACNase ECL EF-Tu kda LysRS PAGE PCR Prr Pnk Rli SDS Anticodon nuclease Enhanced chemiluminescence Translation elongation factor Tu kilo Dalton Lysyl-tRNA Synthetase Polyacrylamide gel electrophoresis Polymerase chain reaction Pnk, Rli restriction Polynucleotide kinase RNA ligase Sodium dodecyl sulfate

תקציר אנטיקודון נוקלאז (אק"נ) הינו אנדוריבונוקלאז ייחודי לטרנספר RNA לליזין ) Lys.(tRNA תפקידו הביולוגי הידוע הוא להגן על החיידק הנושא אותו מהתפשטותה של הדבקת בקטריופאג'. אק"נ התגלה בגזע prr ייחודי המכיל את האתר.E coli אשר מגביל מוטנטים של פאג' T4 חסרי פולינוקלאוטיד קינאז (Pnk) ו/או רנ"א ליגאז.(Rli) אתר זה מקודד לצורה סמויה של אק"נ המכילה את חלבון הליבה PrrC ומערכת הגבלה-מודיפיקציה של DNA מטיפוס I המכונה EcoprrI אשר ממסכת את פעילות.PrrC כאשר פאג' T4 מדביק חיידק נושא prr הוא מפעיל את האק"נ באמצעות פפטיד זעיר (Stp) המהווה גם מעכב של.EcoprrI הפעלת האק"נ גוררת ביקוע של מולקולות ה trna Lys של הפונדקאי בלולאת האנטיקודון תוך יצירת קצוות 2-3 -פוספט ציקלי ו- 5 הידרוקסיל, אולם הפאג' מתקן את הנזק באמצעות Pnk ו- Rli. בהעדרם מדלדל מאגר ה trna Lys התאי ועקב כך נפסקת סינתזת חלבוני הפאג' המאוחרים וההדבקה נעצרת. ביטוי ביתר של גורם ליבת האק"נ PrrC גורם לפעילות אק"נ גלויה שאינה תלויה בהדבקה, אולם בשל רעילותו וחוסר יציבותו לא ניתן היה לבודד את PrrC במצב פעיל. למרות זאת ניתן היה להסיק ש PrrC לא רק נחוץ אלא גם מספיק לפעילות האק"נ שכן פעילות זו נצפתה בתאי יונקים מבטאי.PrrC מסקנה זו אוששה ע"י תוצאות שהושגו בעבודה זו בהן מופו שיירי PrrC המעורבים בהכרת האנטיקודון של.tRNA Lys למיפוי זה קדם פיתוח פרוטוקול ברירת מוטנטים של PrrC פגועים פגיעה חלקית או מלאה בפעילות האק"נ. פרוטוקול זה מושתת על רעילותו של PrrC מגזע בר כאשר מבטאים אותו ביתר תחת בקרת פרומוטר משולב T7-Lac ואתר קישור ריבוזום מפאג' T7 שהינם יעילים במיוחד. אציין כי מצאתי שביטוי PrrC בתנאים אלה היה כרוך בביקוע מספר סובסטרטים משניים, שונים מ,tRNA Lys כנראה בשל ריווי הסובסטרט הראשוני. כיוון שלסובסטרטים משניים אלה היו אנטיקודונים דומים לזה של trna Lys (הם חלקו עימו בסיס או שניים) הוסק שרצף האנטיקודון מהווה סממן הכרות חשוב לאק"נ. 1

הפרוטוקול המוטגני כלל סינתזת PCR מוטגנית של קטעים נבחרים של prrc וברירה לאובדן הרעילות שלאחריה נסרקו המוטנטים לביטוי חלבונים דמויי PrrC באורך מלא בהם חלו חילופי חומצות אמינו. פרטים מקבוצה זו אופיינו במבדקי אק"נ. בדרך זו זוהה בקטע prrc המקודד לרבע השלישי של החלבון צבר מוטציות הפוגעות בפעילות האק"נ ובו שתים שכנות S288P) (D287Y, המשנות את דגם החיתוך. שינוי זה היה כרוך בהסטת אתר הביקוע באחדים מהסובסטרטים המשניים וכן שינוי יחסי ההעדפה של הסובסטרטים השונים. מכאן עלתה הסברה כי שני השיירים שהותמרו שייכים לאתר קישור לאנטיקודון של.tRNA Lys רעיון זה אושש בהמשך באמצעות מוטגנזה מכוונת של אותם שיירים. אחדות מהמוטציות המכוונות הללו התאפיינו גם הן בתבנית חיתוך שונה בדומה לשני המוטנטים המקוריים שנבררו מתוך האוסף האקראי. העובדה כי לא התגלו פנוטיפים דומים במוטציות במקומות אחרים בחלבון מצביעה על כך שאתר ההכרות עשוי להיות מורכב מרצף קצר של שיירים סמוכים. ניתוח נתוני הרצף של PrrC חשף קיום מוטיב חלבוני אופייני לחלבונים קושרי ATP (מוטיב ( DA box-like בחלבון. נוכחותו, בנוסף למוטיב ה P-loop שהיה ידוע קודם, מגדירה את 250 השיירים הראשונים של PrrC כאתר קישור ATP המעורב כנראה בזיקה הממסכת ל.EcoprrI מכאן ניתן להסיק גם כי אתר הנוקלאז עצמו מקנן ביתר החלבון, איזור בו נמצא אתר הכרות האנטיקודון. במהלך המוטגנזה לא נמצאו שיירים המועמדים להיות חלק מאתר פעיל של ריבונוקלאז קלאסי, דוגמת שיירי ההיסטידין שבאתר הפעיל של ריבונוקלאז פנקראטי. כל שיירי היסטידין והשיירים החומציים שהותמרו הותירו מידה שיורית של פעילות אק"נ. מכאן עולה השאלה האם אתר קטליטי קיים ב,PrrC או שמא החלבון פועל כקו-ריבוזים המוציא מן הכוח אל הפועל פוטנציאל ביקוע עצמי הגלום ב trna עצמו. 2

בחינת פיזור המוטציות הפוגעות בפעילות האק"נ על פני prrc הצביע על כך שקישור ATP דרוש לשמירה על מבנהו הפעיל של החלבון. תוצאה אחרת של המוטגנזה הייתה יצירת מוטנטים בעלי פעילות חלקית שניתן לצבור אותם בכמות גדולה יחסית ובשל כך גם לייצב את פעילותם,in vitro תכונה שאפשרה חקירה מקדימה של מבנהו הרביעוני של.PrrC גילוי אתרי prr הומולוגיים בגנומים חיידקיים שרצפיהם נקבעו לאחרונה דוגמת equi, Neisseria meningitidis, Streptococcus ו- ferrooxidans Acidithiobacillus רומז על נפיצות מערכות אנטיקודון נוקלאז לטנטיות בקרב החיידקים. השוואה בין אתרי prr של.E coli ו-.N meningitidis לאתרים המקודדים למערכות הגבלה-מודיפיקציה קרובות חסרות prrc מרמזת על קיום מנגנון רקומבינציה ייחודי, באמצעותו משתבץ גן האק"נ בין הגנים המקדדים למערכת ההגבלה- מודיפיקציה המצומדת. 3

מבוא.1 אנטיקודון נוקלאז אק"נ (2000 (Kaufmann, הינו אנדוריבונוקלאז ייחודי לטרנספר RNA לליזין ) Lys.(tRNA תפקידו הביולוגי הידוע הוא להגן על החיידק הנושא אותו מהתפשטותה של הדבקת בקטריופאג'. מערכת האנטיקודון נוקלאז מעוררת עניין מכמה היבטים. ראשית, היא מהווה דוגמה לשילוב מערכות התגוננות אנטי נגיפיות. שנית, דרך הווצרותה מדגימה יצירת מסלול ביוכימי מורכב בעקבות תחרות בין אלמנטים גנטיים "אנוכיים" כמו פלסמיד ופאג' על תא פונדקאי. שלישית, טמונים בה עקרונות לא ידועים של אינטראקצית חלבון- RNA שלפענוחם עשויות להיות גם השלכות יישומיות שכן אתר המטרה של אק"נ הוא אוניברסלי. במבוא זה אסקור את גילוי מערכת האנטיקודון נוקלאז, תפקידיה הידועים בתא החיידק, הרכבה וכן - נושאה העיקרי של עבודה זו - המנגנון בו מוכר ונבקע הסובסטרט. 1.1 מערכות התאבדות בקטריאליות כאמצעי הגנה אנטי ויראלי תאי חיידקים בודדים מקריבים עצמם לעיתים לתועלת כלל האוכלוסיה. תופעה זו מתרחשת במגוון נסיבות, ביניהן הדבקת פאג' (1995.(Yarmolinsky, במקרים אלו התא המודבק מנטרל פונקציה תאית חיונית וכך מונע את ריבוי הפאג' והדבקת תאים שכנים. שלש מערכות התאבדות המופעלות בעקבות הדבקת תאי.E coli ע"י בקטריופאג' T4 תוארו 1995) (Snyder, הן כוללות את מערכות ה Lit,Rex והאנטיקודון נוקלאז. Rex שמקורה בפרופאג' λ מקודדת לתעלת יונים. תעלה זו מופעלת בעקבות הדבקה בזני T4 מוטנטים באתר rii או בזנים מוטנטים של מספר פאג'ים אחרים. ההפעלה גורמת לזליגת יונים, הרס פוטנציאל הממברנה ובעקבות זאת מות התא (1992 al.,.(parma et מערכת ה Lit מקודדת ע"י הפרופאג' הלמבדואידי הפגום e14 והפעלתה דורשת תחילה מוטצית פרומוטור. כאשר T4 מדביק חיידק המבטא את Lit הוא גורם לפרוטאז זו לבקוע את גורם התרגום.Elongation factor Tu ההכוונה נעשית באמצעות פפטיד המהווה חלק מחלבון 4

מבני של הנגיף 1994) Snyder,.(Yu and כאמור, גם אק"נ שמקורה כנראה בפלסמיד קוניוגטיבי משבשת את מנגנון התרגום בכך שהיא פוגעת ב.tRNA Lys ניתן להתייחס לשלש מערכות הגנה אלה כאמצעים בהם אלמנטים גנטיים אנוכיים דוגמת פרופאג'ים או פלסמיד שהתאזרחו בחיידק נאבקים באלמנט גנטי אחר, פאג' T4 במקרים דנן. אגב כך מוענקת הגנה גם לתא הפונדקאי. 1.2 גילוי האק"נ אנטיקודון נוקלאז התגלה בעקבות חיפוש תפקידים ביולוגיים של שני אנזימים המקודדים ע"י בקטריופאג' polynucleotide kinase (pnk) :T4 ו-( rli ).RNA ligase אנזימים אלה אינם נחוצים להתרבות הפאג' על זני מעבדה שכיחים של.E, coli אולם פאג'ים החסרים אחד מהם אינם גדלים על בידוד קליני של CT196.E, coli וגזעים הנגזרים ממנו (Depew and 1974) Cozzarelli,.(Runnels et al., 1982); (Sirotkin et al., 1978); האלמנט הגנטי האחראי להגבלה - prr (שמו על שום ( pnk rli restriction מופה לדקה ה 29 בכרומוזום החיידק 1984) Snyder,.(Abdul-Jabbar and כאשר פאג' T4 מדביק חיידק נושא prr הוא מפעיל ריבונוקלאז סמוי הבוקע את מולקולות ה trna Lys בלולאת האנטיקודון, ומכאן השם אנטיקודון נוקלאז (אק"נ) 1982) al.,.(amitsur et al., 1987); (David et 1.3 מנגנון הגבלת - prr אק"נ האק נ מצוי בתא במצב לטנטי. משהוא מופעל, בעקבות הדבקה בפאג' T4, הוא בוקע את מולקולות ה trna Lys בלולאת האנטיקודון בין בסיסים 33 ו- 34 כשהוא מותיר מצד אחד 2-3 -פוספט ציקלי ומצד שני 5 הידרוקסיל. ביקוע זה מדלדל את מאגר ה trna Lys התאי, שכן שעתוק כרומוזום החיידק מושתק תכף לתחילת ההדבקה ואילו הפאג' אינו מקודד ל trna Lys משלו. כאשר מודבק חיידק נושא אק"נ ע"י פאג' החסר את אחד האנזימים Pnk ו- Rli אין אפשרות לתקן את הפגיעה, סינתזת חלבוני הפאג' המאוחרים נפסקת וההדבקה נעצרת 1978) al.,.(sirotkin et לעומת זאת, בנוכחות אנזימי התיקון משוחזרות המולקולות הבקועות ופעילותן מושבת (1987 al., Amitsur )(תמונה et (a)1.1). 5

הי- 1.4 ביקוע ותיקון ה Lys - trna מסלול שחבור RNA נטול אינטרון תיקון ה trna Lys שנבקע ע"י אק"נ מתבצע בשני שלבים. ראשית הקשר הפוספודיאסטרי עובר הידרוליזה, תחילה ליצירת 3 -פוספומונואסטר ובהמשך 3 -הידרוקסיל (Amitsur et פעילויות אלה מצויות ב Pnk בנוסף על פעילות הקינאז באמצעותה מזורחן.al., 1987) הקצה ה-.(Sirotkin et al., 1978); (Cameron and Uhlenbeck, 1977) 5 -OH מכאן שמו המלא של האנזים.Polynucleotide kinase-3 -phosphatase בשלב השני מאחה האנזים (Amitsur et Pnk את הקצוות המעובדים ע"י Rli ומשחזר את מולקולת ה trna Lys השלמה אם כן, (1987.al., שלושת האנזימים אק"נ, Pnk ו- Rli יוצרים יחד מעין מסלול שחבור בעל מאפיינים דומים לשחבור pre-trna יוקריוטי. אלא שבמקרה שלפנינו נחתך ה trna ומאוחה מחדש ללא החסרת אינטרון. לעומת זאת, שחבור ה pre-trna נפתח כאשר אנדו- ריבונוקלאז בוקע את מולקולת ה pre-trna משני עברי אינטרון הנמצא בלולאת האנטיקודון כשהוא מותיר בקצוות 2-3 -פוספט ציקלי ו- 5 דרוקסיל. לאחר מכן עובר הקשר הפוספודיאסטרי הידרוליזה חלקית המותירה 2 -פוספט ו- 3 -הידרוקסיל והקצה ה- 5 -OH מזורחן. שני הקצוות מאוחים לקבלת מולקולת trna עם סרח עודף של 2- פוספט, המוסר בהמשך ע"י פוספוטרנספראז מתמחה המעבירה אותו לנגזרת ניקוטין-אדנין דינוקלאוטיד 1998) al., (Abelson et (תמונה.(1.1 מסלול החיתוך-חיבור של האק"נ רומז על האופן בו עשויים להווצר מסלולים ביוכימיים מורכבים כתוצאה מפעולות ניגודיות של אלמנטים גנטיים עצמאיים המתחרים ביניהם (הפלסמיד נושא prr והפאג') על מרחב המחיה של אותו תא פונדקאי. אין ספק כי קיים קשר אבולוציוני לפחות בין אחדים ממרכיבי מסלולי שחבור הפרקורסורים של טרנספר RNA ביוקריה (הפולינוקלאוטיד קינאז-רנ"א ליגאז) למקביליהם במסלול הביקוע והאיחוי של trna Lys בחיידק. לעומת זאת אין כל דמיון במבנה ראשוני בין הנוקלאזות הפותחות את התהליכים. למרות זאת ייתכן שדמיון כלשהו יימצא בעתיד בפרטים מנגנוניים או של מבנה מרחבי מאחר והן יוצרות קצוות ביקוע דומים. 6

1.6 מערכות רסטריקציה מודיפיקציה מטיפוס (Hsd) I מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מגינות על החיידק הנושא אותן מפני חדירת DNA זר. מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס (hsd, host specificity determinant) I אליהן משתייך EcoprrI מהוות תצמיד רב תת-יחידתי המזהה את רצף המטרה ב DNA ופועל באופן אלטרנטיבי בהתאם לנוכחות או העדר מודיפיקציה ברצף זה (ראה סקירה (2000.((Murray, ברצף ממותל למחצה ממתל האנזים את הגדיל חסר המודיפיקציה. בהעדר כל מודיפיקציה מועבר דרך האנזים מקטע DNA ארוך החל מאתר ההכרות ועד לאתר הביקוע העשוי להיות מרוחק כדי מאות עד אלפי בסיסים. סבורים כי מרחק זה מייצג את נקודת המפגש בין מולקולות אנזים הפועלות על אתרי הכרות שכנים ו"נעות" זו לקראת זו. לפעילויות מערכות Hsd דרושים S-Adenosylmethionine, ATP ויוני מגנזיום כקופקטורים. מבין תוצרי שלשת הגנים HsdS אחראי לקישור רצף ההכרות ב,DNA למתילציה ו- HsdR לטרנסלוקציה וביקוע ה.DNA לשתי הפעילויות האחרונות HsdM דרוש התצמיד המלא הפנטאמרי 1 R 2 M 2 S בעוד שלמיתול מספיק.M 2 S הבדל זה מסביר כיצד מתמסדת המערכת בתא; דהיינו, ביטוי המתילז לפני הנוקלאז מונע פגיעה ב DNA התושב. מערכות רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס I נחלקות לארבע משפחות,.A-D מערכות המשתייכות לאותה משפחה חולקות הומולוגיה גבוהה וניתן ליצור ביניהן צרופי תת-יחידות כימריים פעילים. פרטים של אותה משפחה נבדלים ביניהם בעיקר באזורי הכרת רצף ה DNA שבתת היחידה.HsdS 1.7 מקורה של מערכת prr באלמנט גנטי נייד שהתאזרח בכרומוזום ה.E coli מערכות הומולוגיות ל EcoprrI מטיפוס IC דוגמת EcoR124I נישאות על פלסמידי R קוניוגטיבים. למערכות אלו יש במקום prrc מרווח בין גני בין hsds ל hsdr באורך של EcoprrI כ 120 בסיסים (תמונה 1.2). כנראה ש prrc חדר לתוך מרווח זה במערכת ה המקורית R והמערכות ההומולוגיות הנישאות על פלסמידי prr.(linder et al., 1990) 8

סמוכות לרצפים דמויי סיגנל אריזה של פאג' (pac packaging signals) P1 ולמערכת (Tyndall et ; (Lehnherr et al., 1993) הממכרת את התא לפלסמיד הנושא אותה phd/doc דימיון זה רומז שמקורה של מערכת prr בפלסמיד R או בפרופאג'. כאמור,.al., 1997) מערכות התאבדות נוספות הפועלות כנגד הדבקת פאג' T4 מקודדות אף הן ע"י אלמנטים גנטיים שעברו אינטגרציה לכרומוזום החיידק (1995.(Snyder, Stp 1.8 גורם T4 המשפעל את האק"נ הלטנטי נוגדנים כנגד EcoprrI שיקעו יחד עם מערכת זו את פעילות האק"נ ואת PrrC trna Lys ומכאן שמערכות הרסטריקציה כנגד (Morad et al., 1993); (Amitsur et al., 1992) מצומדות גם ברמת החלבון. משמעויות פיזיולוגיות ואבולוציוניות אפשריות ונגד DNA של הצימוד בין שתי מערכות ההגבלה נרמזו ע"י אפיון,Stp פפטיד דו-תכליתי המקודד ע"י בקטריופאג T4. rli או ב pnk פגועים ב התגלה כסופרסור אקסוגני של מוטנטי T4 Stp 1982); al.,.(runnels et זהו פפטיד באורך 26 חומצות (Depew and Cozzarelli, 1974) אמינו המקודד באזור בלתי חיוני בגנום הפאג' 1988) al., (Amitsur et al., ; (Chapman et (1989. התברר כי Stp מעכב את מערכת ההגבלה כנגד,DNA קרוב לודאי המטרה ה"מיועדת" של הפאג', ומפעיל אגב כך את האנטיקודון נוקלאז (1995 al.,.(penner et מכאן מסתבר מנגנון הסופרסיה: ללא Stp אין הפעלה של האק"נ, אין ביקוע של trna Lys ואין צורך באנזימי התיקון (1986 al.,.(kaufmann et עיכוב מערכת ההגבלה כנגד ה DNA אינו תלוי בנוכחות,PrrC ולכן סביר שמטרתו הראשונית של Stp היא מערכת EcoprrI (1995 al.,.(penner et ניתן לתאר תרחיש אבולוציוני בו רכש החיידק בשלב ראשון את מערכת הרסטריקציה כנגד ה,DNA הפאג' השיב ברכישת פפטיד המנטרל את המערכת הזו, החיידק הוסיף "מוקש" בדמות אנזים כנגד trna המופעל עם ניטרול המערכת כנגד ה DNA ולבסוף הפאג' רכש שני אנזימים המתקנים את הנזק ל trna ומאפשרים לו להמשיך בהדבקה ללא הפרעה (תמונה 1.3). 9

לפונדקאי. פאג' T4 מבטא את הפפטיד Stp בבואה של מאבק נמשך בין פאג' האק"ננננ: מערכת תמונה 1.3: המנטרל את,EcoprrI מערכת הגבלה כנגד,DNA ואגב כך מפעיל את האק"נ הבוקע את מולקולות ה trna Lys החיוניות להתרבות הפאג'. Pnk ו- Rli המקודדים ע"י הפאג' מאחים את מולקולות ה trna ומשיבות להן את פעילותן. PrrC 1.9 אחראי לפעילות האק"נ (Morad et al., כפי שהוזכר, ביטוי ביתר של PrrC משרה פעילות אק"נ גלויה בתאי.E coli (1993. למרות ש PrrC טרם נוקה בצורה פעילה הוא הופרד מיתר מרכיבי החיידק ע"י.(Shterman et al., 1995) ביטויו בתאי יונקים שאף בהם השרה ביקוע של trna Lys מכאן שזהו מרכיב.E coli היחיד הדרוש לפעילות אק"נ וכנראה המרכיב היחידי בכלל. סברה (Meidler et זאת נתמכת ע"י זיהוי אזור ב PrrC המעורב בהכרת האנטיקודון של trna Lys.(Jiang et al., 2001); al., 1999) PrrC 1.10 הינו בלתי יציב בהעדר גורם המיסוך EcoprrI מתערערת יציבות.PrrC כך, כאשר מבטאים את PrrC מפלסמיד בעל מספר עותקים קטן ומאתרי בקרת השעתוק והתרגום הטבעיים, לא ניתן לזהות את פעילות הליבה. מאידך, אם EcoprrI מבוטא בטרנס ניתן לזהות את הפעילות הלטנטית באותה רמת ביטוי של.PrrC לעומת זאת, כאשר מבטאים את PrrC לבדו ביתר, פעילותו הגלויה נצפית. יתר על כן, בתנאים אלה היא גם מעכבת את גידול התא. זמן 10

מחצית החיים של פעילות ליבת האנטיקודון נוקלאז בתמציות תאים ב 30 C פחותה מדקה בעוד שב 10 C היא עולה על שעה, דבר המלמד על חוסר יציבות תרמלית של החלבון. חוסר יציבותו של גורם הליבה החופשי מגן בלי ספק על התא מפני רעילות אפשרית (1993 al.,.(morad et כיוון ש PrrC מפריע לתרגום החלבונים, נמנעת הצטברותו כאשר הוא מבוטא תחת אלמנטי בקרת שעתוק ותרגום חזקים. שני קשיים אלה - רעילות לסינתזת חלבון וחוסר יציבות - מנעו עד לאחרונה את טיהורו של PrrC במצב פעיל ולו טיהור חלקי. דבר זה הקשה על אפיון ביוכימי ומבני של החלבון. לפיכך הסתמכתי בעבודה זו בעיקר על אנליזת מוטציות שנועדה לזהות אתרי PrrC המעורבים בפעילות האק"נ. חיפוש זה הודרך ע"י השערת עבודה בדבר חלוקתו של PrrC לאזורים מבניים-פונקציונליים. 1.11 חלוקה מבנית-פונקציונלית משוערת של PrrC קיומן של שתי פונקציות קישור ל EcoprrI וביקוע trna Lys מרמז על קיומם של אזורים מבניים מקבילים (Domains) ב.PrrC המצאות מוטיב P-loop המאפיין חלבונים או אזורים קושרי A/GTP בחלק האמיני של החלבון הורתה על קיומו של אזור אמיני קושר נוקלאוטיד בחלק זה (1993 al., Morad )(ראה et תמונה מס' 3.15). אזורים כאלו הם בעלי גודל טיפוסי של כ 200 חומצות אמיניות 1990) al.,.(saraste et שתי מוטציות נקודתית באזור זה מפרות את האינטראקציה שבין PrrC ל EcoprrI מבלי לבטל את פעילות ליבת האנטיקודון נוקלאז (1994 (Benjamin,.(Rozner,,(1999 יתר על כן, ATP ו GTP נחוצים להפעלת האנטיקודון נוקלאז הלטנטי (1992 al.,,(amitsur et בעוד שאנלוגים קשי-הידרוליזה, ATPγS ו,GTPγS מבטלים פעילות זו. מאידך, להוספת הנוקלאוטידים האגוניסטיים או האנטגוניסטיים האלה לא הייתה השפעה על פעילות הליבה בתמצית הגולמית (Morad et 1993) al.,. Amitsur et al., in prep. ; מעובדות אלה הוסק שהאיזור האמיני קושר נוקלאוטיד ואחראי לזיקת PrrC לגורמים הממסכים. כמו כן הוסק שהפעלת האנזים הלטנטי תלויה בהידרוליזת הנוקלאוטיד. על דרך השלילה ניתן להניח כי פעילות הליבה, כלומר הכרות וביקוע,tRNA Lys שוכנת ביתרת החלבון. יש גם לציין כי לקטע הגן המקדד לרבע 11

השלישי של PrrC תכולת GC נמוכה מהאזורים האופפים אותו ומזו של הגנים הממוצעים של.E, coli דבר המרמז על מוצא גנטי שונה ואולי גם על פונקציה חלבונית נבדלת המתנהגת כיחידת סלקציה עצמאית (1993.(Chapman-Shimshoni, בהתאם לכך יתכן כי ב PrrC שלושה אזורים מבניים כאשר אחד או שניים מהקרבוקסיליים שבהם אחראים לקישור הסובסטרט trna Lys ובקיעתו. PrrC 1.12 שונה מריבונוקלאזות קלאסיות כאמור PrrC מותיר קצוות 2-3 -פוספט ציקלי ו- 5 הידרוקסיל. קצוות כאלה נוצרים גם ע"י אנטיקודון נוקלאז בעלת ספציפיות שונה שהתגלה לאחרונה במולקולות Colicin E5 ע"י 1999) al.,,(ogawa et אנדוריבונוקלאזות שחבורpre-tRNA (Abelson et al., 1998) וריבוזימים בוקעי-עצמם 1993) al.,.(pan et ריבונוקלאזות "קלאסיות" דוגמת ריבונוקלאז פנקראטי, יוצרות אותם אף הן בשלב ראשון של פעולתן, אולם אנזימים אלה ממשיכים בהידרוליזה של הפוספודיאסטר הציקלי בשלב שני המשיב את האתר הקטליטי שלהם למצבו ההתחלתי (1993.(Gerlt, באתר הקטליטי של ריבונוקלאז פנקראטי מתפקידם שני שיירי היסטידין (H119,H12) כמוסרי ומקבלי פרוטון בראקציות אלה ושייר ליזין (K41) מייצב את הפוספט הפנטמרי של מצב המעבר. מספר שיקולים רומזים ש PrrC אינו פועל בדומה לריבונוקלאזות הקלאסיות גם בראקצית הטרנסאסתריפיקציה. ראשית, PrrC בוקע את הסובסטרט מצד '3 ל- U33 שהוא בסיס משותף לכל סוגי ה trna ואחראי ל"תפנית הפרסה" (U-turn) בלולאת האנטיקודון 1999) al.,.(ashraf et מסיבה זו לא יכול U33 לשמש גורם היכרות מקביל לזה של ריבונוקלאזות הקלאסיות אשר בוקעות את הסובסטראט מצד 3 לבסיס ייחודי דוגמת בסיס פירמידיני (ריבונוקלאז פנקראטי) או G (ריבונוקלאזT1 ) וגם מגיבות עם נוקלאוטיד בודד נושא בסיס תואם. מאידך, סביר (וכך אומנם נמצא 1999) al., ((Jiang et al., 2001); (Meidler et שאק"נ מכיר את שלשת בסיסי האנטיקודון של הסובסטרט המבדילים אותו מסוגי trna אחרים. גם העדר שייר היסטידין באזור הפעיל של (Ogawa et al., (1999 Colicin E5 ואי היכולת לאתר שייר היסטידין פעיל ב PrrC 12

במוטגנזה כפי שיתואר בהמשך (ראה סעיף 3.3) אינם מתיישבים עם קיום מנגנון ריבונוקלאוליטי קלאסי באק"נ. 1.13 אופן הכרת הסובסטרט ע"י PrrC השוואת trna Lys יוקריוטי ופרוקריוטי הנבקעים ע"י אק"נ עם סוגי trna שאינם מוכרים ע"י האנזים מורה כי אזור ההכרות של האק"נ כולל את לולאת האנטיקודון ושני זוגות הבסיסים בתחתית הגבעול 1995) al.,.(shterman et בתוך אזור זה עשוי רצף האנטיקודון להיות אלמנט הכרות עיקרי. תוצאות מעבודה זו מאשרות הנחה זו ומרחיבות את הבנת המנגנון בו מכיר PrrC את הסובסטראט. בניגוד ל trna-lysyl synthetase המכיר את האנטיקודון של trna Lys באמצעות מוטיב ה OB בו פזורים השיירים מכירי הסובסטרט בין מספר אלמנטים שניוניים, PrrC עושה זאת כנראה באמצעות צבר קצר ורצוף של שיירי חומצות אמיניות 1999) al.,.(meidler et הבדלים בין מנגנוני ההכרות של שני החלבונים נרמזים גם מאנליזת מוטציות מאוחרת יותר של הסובסטראט (2001 al.,.(jiang et מכאן שלימוד מנגנון הכרת הסובסטרט ע"י האק"נ עשוי לחשוף עקרונות הכרות חלבון- RNA חדשים. לכך עשויות גם להיות השלכות מעשיות שכן, בהיותו מופנה כנגד מטרה אוניברסלית משומרת, יש לאק"נ פוטנציאל נרחב של שימושים ציטוטוקסיים או אנטי (Shterman et al., 1995) אנושי trna Lys,3 ויראליים. דוגמה לכך היא יכולתו לבקוע המהווה את יזם השכפול של ה.(Mak and Kleiman, (1997 HIV הזדקקות HIV למרכיב תאי זה אינה מושפעת מחוסר יציבותו הגנטית של הנגיף (1995 al., (Wakefield et ;.AIDS לשמש מטרה לפיתוח תרופות נוגדות trna לכן עשוי Lys3,(Wakefield et al., (1996 כמו כן יש לאק"נ פוטנציאל לשמש כמעכב סינתזת חלבון, ואמצעי לסילוק trna ייחודי מתערובת, למשל למטרות סינתזת חלבונים מלאכותיים ע"י החדרת חומצות אמינו מלאכותיות לחלבון ע"י קישורן לtRNA ספציפי 1995) al.,.(mendel et 13

מטרות העבודה מטרתה העיקרית של עבודה זו הייתה לזהות את האתר הפעיל של האק"נ באמצעות מוטגנזה אקראית וסלקציה פונקציונלית מלווים במבדקי פעילות האנזים. במהלך העבודה זוהה אתר הכרות הסובסטרט ובשל כך הוחלט להמשיך ולחוקרו במוטגנזה מכוונת. מטרה נוספת שהוגדרה עקב זיהוי הומולוגים ברצפי גנומים של חיידקים שונים שהופיעו במהלך העבודה במאגרי מידע הייתה עיבוד נתוני רצף מהם ניתן ללמוד על ארגונו המבני של.prr ואופן הווצרו של אתר האק"נ הלטנטי PrrC ממצאים עיקריים בעבודה זו נמצא ב PrrC אתר קישור משוער לאנטיקודון של trna Lys באמצעות שתי מוטציות שכנות משנות פנוטיפ החיתוך של האק"נ (1999 al.,.(meidler et בהמשך אושש הרעיון בדבר תפקידו של אתר ההכרות ע"י פנוטיפים של מוטציות נוספות שהוכוונו אליו. כמה ממוטנטים אלה היו חשובים בזיהוי זיקה ייחודית בין החלבון לבסיס הפקפוק.(Jiang et al., 2001) באנטיקודון של הסובסטראט (wobble) כמו כן התקבלו ראיות בדבר.(Meidler et al., 1999) חשיבותו של רצף האנטיקודון כאלמנט הכרות מרכזי ב trna Lys ניתוח נתוני רצפי DNA הומולוגיים מחיידקים אחרים חשף קיום מערכות אק"נ לטנטי מקבילות (ראה סעיף 3.4). קיומן וזיהוי מוטיב קישור ATP ב PrrC תרמו להבנה מעמיקה יותר של ארגונו התפקודי של חלבון ליבת האנטיקודון נוקלאז. זיהוי מוטנטים בעלי פעילות חלקית אפשר גם לבטא את החלבון ביתר ובכך לתרום ליציבותו במבחנה.(Blanga et al., in prep.) 14

ושיטות חומרים.2 2.1 חומרים אנזימי רסטריקציה, T4 DNA Ligase ו- T4 RNA ligase נרכשו מחברת.NEB נוקלאוטידים ופוספט אנאורגני מסומנים רדיואקטיבית נרכשו מחברת.Amersham פולינוקלאוטיד קינאז נרכש מחברת.USB נוקלאז.Pharmacia נרכש מחברת P1 במקרים שלא צוין אחרת, סופקו הבופרים לריאקציה ולמיהול האנזימים ע"י היצרן. Taq אוליגונוקלאוטידים נרכשו מחברת ביוטכנולוגיה כללית או מחברת.Gibco BRL.Bioline או חברת MBI Fermentas היה מתוצרת חברת DNA polymerase סרטי צילום ומסכי הגברה היו מתוצרת חברת.Kodak 2.2 גזעי חיידקים גזע תכונות רלונטיות מקור K38 HfrC (Russel and Model, 1984) JM107 F -,[supe44,thi1,leub6,lacy1,tona2] (Yanisch-Perron et al., 1985) rela1,f [trad36,proab,laci q,lacz JM107prr tet r prr + - transductant of JM107 (Penner et al., 1995) DH10B lacpro,enda1,gyra,thi1,hsdr17,supe44, (Grant et al., 1990) רשימת פלסמידים מקור תאור פלסמיד 2.3 פרומוטור PRRC6 תחת בקרת T7 PrrC פלסמיד לביטוי (Morad et al., 1993) פלסמיד לביטוי PrrC תחת בקרת prrc11 T7-lac פרומוטור ובקרת התרגום של T7φ10 פלסמיד וקטור לביטוי תחת בקרת T7 פרומוטור pt7-5 פלסמיד לביטוי pol. T7 RNA תחת בקרה תרמית pgp1-2 הומולוג PrrC מ- N. meningitidis משובט pnme ב- SK (Stratagene) pbluescript (Meidler et al., 1999) S. Tabor (Tabor and Richardson, 1985) עבודה זו 15

2.4 רשימת אוליגונוקלאוטידים N o Sequence 1 5`-GCCCATGGCATGCCTCTGCTACTTC-3` 2 5`-CCACCATGGCGCGCGAGACCCACGC-3` 3 5`-GAGGCATCATATGGGCAAG-3` 4 5`-GGGGATCCTCTTCAACCATTTTTTTGTTCC-3` 5 5`-GGGGTACCTTTGCCCTCACAGAAAAATATNNNGACTC-3` 6 5`-GGGGTACCTTTGCCCTCACAGAAAAATATGGCNNNTCTAAC-3` 7 5`-GGGGTACCTTTGCCCTCACAGAAAAATATGGCGACNNNAACAAG-3` 8 5`-GGGGTACCTTTGCCCTCACAGAAAAATATGGCTTCTCTAAC-3` 9 5`-GGGGTACCTTTGCCCTCACAGAAAAATATGGCCACTCTAAC-3` 10 5`-GCGAATTCCCGGGTCTTTAGATCATGCCG-3` 11 5`-GCGGATCCTAGGTCATGGCTTATCTCTTTG-3` 2.5 שיטות 2.5.1 מבדק אק"נ in vivo חיידקי K-38:pGP1-2 נושאי פלסמיד ביטוי PrrC גודלו ב 30ºC במצע LB בנוכחות 800 µg/ml אמפיצילין ו- 50 µg/ml קאנאמיצין עד לצפיפות 0.2. OD החיידקים נקצרו, הורחפו מחדש במדיום דל-פוספט LP) מועשר) וסומנו ע"י 10 µl 32 P-Pi Ci/mmol) 10) mci/ml-3000 במשך 45 דקות ב.30ºC לאחר סילוק שאריות החומר הרדיואקטיבי הושרה ביטוי רנ"א פולימרז של פאג' T7 המקודד ע"י pgp1-2 ע"י העלאת הטמפרטורה ל 42ºC למשך 20 דקות. במקרה הצורך (פלסמיד prrc11 ונגזרותיו) הוסף גם. 1 mm IPTG לאחר אינקובציה נוספת של 20-45 דקות ב 30ºC נקצרו החיידקים ו RNA נמוך מולקולרי מוצה מתוכם בפנול. לאחר שיקוע אתנולי ושטיפה אתנולית הומס המשקע ב 5-20 µl של 10M urea, 0.01% xylene cyanol בהתאם לכמות הקרינה. דגימות הופרדו על גל 15% פוליאקרילאמיד ברזולוציה רגילה (ראה בהמשך). 16

מבדק אק"נ in vivo שלאחריו סימון קצה in vitro בעזרת פולינוקלאוטיד קינאז 2.5.2 חיידקי K-38:pGP1-2 נושאי פלסמידי ביטוי PrrC גודלו ב 30ºC ב 3 ml של LB בנוכחות 800 µg/ml אמפיצילין ו- 50 µg/ml קאנאמיצין עד לצפיפות 0.5-0.8. OD אינדוקציה בוצעה ע"י העלאת הטמפרטורה ל 42ºC למשך 20 דקות. במקרה הצורך (פלסמיד prrc11 ונגזרותיו) הוסף גם 1. mm IPTG לאחר אינקובציה נוספת של 20-45 דקות ב 30ºC נקצרו החיידקים ו RNA נמוך מולקולרי מוצה מתוכם בעזרת פנול. לאחר שיקוע אתנולי ושטיפה אתנולית הומס ה RNA ב 5 µl מים מטופלים ב.DEPC מחצית מה RNA סומנה בריאקציה בנפח 5 µl שהכילה Pnk buffer (מסופק ע"י היצרן) 1 µl אנזים Pnk מהול 1:4 בבופר מיהול ו-.(10 mci/ml-3000 Ci/mmol) 1 µl γ[ 32 P]-ATP הריאקציה נמשכה 10 דקות בטמפרטורת החדר והופסקה ע"י הוספת 50 µl אמוניום אצטט 2, M שיקוע אתנולי ושטיפה אתנולית. בשל כמות ה ATP המגבילה מסתמנים בעיקר קצוות ' 5 -הידרוקסיל החשופים בלולאת האנטיקודון הפגומה. לעומת זאת, קצוות ' 5 -פוספט החבויים במבנה הקומפקטי של ה trna כמעט שאינם מסתמנים בתנאים אלה בראקצית השחלוף היעילה פחות. המשקע הומס ב 5-20 µl של 10M urea, 0.01% xylene cyanol בהתאם לכמות התוצר. דגימות הופרדו באלקטרופורזת גל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה או רגילה (ראה בהמשך). 2.5.3 מבדק אק"נ in vitro הבדיקה מבוססת על ביקוע trna Lys המסומן בחוליית הביקוע (בין שיירים 33-34). (Amitsur et הביקוע מותיר את הסימון במקטע 1-33. הכנת הסובסטרט בוצעה כמתואר ב (1989.al., כמקור לאנזים שימשה תמצית 150-S או תמצית 30-S של התאים המצוינים שהוכנה כמתואר ב 1993) al.,.(morad et ריאקציה אופיינית בוצעה בנפח.5µl תערובת הריאקציה הסטנדרטית, שהוכנה ב 0 C, הכילה: 1 µl תמצית 150-S, 5,000 cpm,7 mm EDTA,35 mm Tris-HCl, ph 8.0,(3,000 Ci/mmol) [ 32 P]-tRNA Lys,10 mm MgCl 2,3.5 mm β ME,7 mm NaCl 7% סוכרוז, 7% גליצרול. כמו כן הוסף 17

קוקטייל מעכבי פרוטאזות מתוצרת חברת.Boehringer הריאקציה נפתחה ע"י הוספת הסובסטרט הרדיואקטיבי והופסקה לאחר הדגרה של שעתיים ב 10 C ע"י הוספת 50 µl.0.2% SDS בופר אצטט ;ph 5.5 0.3M RNA נמוך מולקולרי מוצה בפנול ושוקע באתנול בנוכחות.Carrier trna המשקע נשטף ב 70% אתנול והומס ב 10 µl של urea, 10M 0.01%. xylene cyanol דגימות הופרדו על גל פוליאקרילאמיד ברזולוציה רגילה (ראה בהמשך). 2.5.4 יצירת ספריות מוטציות אקראיות מקטעי prrc נחתכו מתוצר PCR שסונתז עם Taq DNA polymerase ופריימרים מס' 3,4 (ראה - 2.4 רשימת נוקלאוטידים). בתנאים אופטימליים מבצע הפולימראז שגיאה כל 10 5 בסיסים 1992) Joyce,.(Cadwell and לפיכך בריאקציה של 40 מחזורים יש לצפות לשיעור מוטציות של לפחות שגיאה אחת לכל 2,500 בסיסים בקטע הרלוונטי. בספרייה הראשונה שובט מקטע באורך 340 בסיסים, כך שניתן היה לצפות בתנאי ריאקציה אופטימליים למוטציה אחת בכל שבעה עותקי מקטע. כדי להעלות במעט את שיעור המוטציות בספרייה זו הועלה ריכוז המגנזיום מ 1 mm ל.(Cadwell and Joyce, 1992) 2 mm בספריה השניה שובט מקטע באורך 730 בסיסים כך ששיעור המוטציות הצפוי היה בקרוב אחת לארבע, שיעור נמוך דיו כדי שרוב המוטציות המתקבלות יהיו יחידאיות וגבוה מספיק כדי להזניח את המוטציות הספונטניות ולקבל שיעור מוטנטים גבוה בקרב המושבות שנאספו. בספרית המוטנטים הראשונה שובט המקטע EcoR V - BssH II המקודד לחומצות אמינו 200-313. נדרש שיבוט לפלסמיד ביניים, שכן אתרים אלו אינם יחידאיים בפלסמיד המטרה.pRRC11 המקטע שובט תחילה ל prrc6 והוכנס באמצעות אלקטרופורציה לחיידקים מזן.DH10B כאלף מושבות נאספו יחד והפלסמידים הופקו מהם. מפלסמידים אלו נחתך מקטע Nco I - BamH I ששובט לפלסמיד המטרה.pRRC11 ספריות הפלסמידים שהתקבלו הוחדרו לחיידקי,DH10B כאלף מושבות נאספו, הפלסמידים הופקו והוחדרו לחיידקי K-38:pGP1-2 בהם בוצעה הסלקציה (ראה סעיף 2.5.9). ספריית המוטנטים השנייה נוצרה ע"י שיבוט ישיר של מקטע,Nco I - BamH I המקודד לשיירים 156-396, 18

לפלסמיד.pRRC11 ספריות הפלסמידים שהתקבלו הוחדרו לחיידקי,DH10B כאלף מושבות נאספו, פלסמידים הופקו והוחדרו לחיידקי K-38:pGP1-2 בהם בוצעה הסלקציה (ראה 2.5.9). מושבות ששרדו את הסלקציה נבדקו לביטוי חלבון דמוי,PrrC לפעילות אק"נ (במרבית המקרים) וכן נקבע רצף ה DNA של מקטע ה PCR ששובט בהם. 2.5.5 יצירת מוטנטי חסר מוטנטים שהכילו חוסרים פנימיים נוצרו ע"י חיתוך באנזימי רסטריקציה. שני המוטנטים הקטועים בחלק האמיני נוצרו מהפלסמיד prrc6 בעזרת.PCR המוטנט החסר את האזור עד חומצת אמינו 156 נוצר כך: מקטע PCR של רצף שבמעלה ל,prrC שבקצהו הגובל בגן הוכנס אתר Nco I (פריימר מס' 1, ראה 2.4), עבר ליגציה למקטע שהוכן ע"י חיתוך הפלסמיד באתר ה Nco I הפנימי שבגן prrc ובאתר Eco RI שבמעלה לגן. המוטנט החסר את החלק שעד חומצה אמינו 200 נוצר בעזרת אותו מקטע,PCR ובנוסף אליו בעזרת מקטע PCR נוסף של הרצף שבמורד לחומצת אמינו 200 שבקצהו הוכנס אתר Nco I (פריימר מס' 2, ראה 2.4). שני מקטעי ה PCR עברו ליגציה למקטע שהוכן ע"י חיתוך הפלסמיד באתר Eco RI שבמעלה הגן ובאתר Bam HI שבמורד לגן. בכל המקרים הוכנסו תערובות הליגציה ל,DH10B הפלסמידים הופקו והוחדרו ל K-38:pGP1-2 בהם נבדקו פעילות האק"נ והחלבון. 2.5.6 יצירת חלבון איחוי MBP-PrrC הגן prrc סונתז ב PCR ושובט בפלסמיד pmal-c (חברת (NEB בין אתרי EcoR I ו- Hind III בהמשך לגן male המקודד ל MBP תחת בקרת פרומוטור tac ואלמנטי בקרת התרגום של.MBP במערכת זו חסר סיגנל ההפרשה לפריפלסמה, כך שחלבון האיחוי נותר בציטופלסמה. הפלסמיד הוחדר באלקטרופורציה ל.DH10B הביטוי הבזלי שהתקבל גרם לסלקציה שהותירה רק מוטנטים חסרי פעילות אק"נ. 19

2.5.7 שיבוט ההומולוג של PrrC מ N.meningitidis-MC58 ב.E coli הגן חולץ ב PCR מה DNA הגנומיאלי של N.meningitidis-MC58 יחד עם 46 בסיסים במעלה הזרם, הכוללים לפי ההשערה את אזור בקרת התרגום (פריימרים מס' 10,11, ראה 2.4). תוצר ה PCR שובט לפלסמיד SK (חברת (Stratagene בין אתרי EcoR I ו- BamH I תחת בקרת פרומוטור T7. הפלסמיד שהתקבל,,pNME עבר אלקטרופורציה לתאי DH10B ובהמשך לתאי,K-38:pGP1-2 המבטאים את ה T7 RNA polymerase תחת בקרה תרמית. רצף הגן המשובט נקבע ונמצא זהה (למעט מוטציה שקטה) לרצף גזע הבר, שנקבע בעזרת תוצרי PCR שהתקבלו מה DNA הגנומיאלי של.N.meningitidis-MC58 2.5.8 יצירת מוטציות מוכוונות בעמדות 286-288 עבור כל אחד משיירי חומצות אמינו,G286,D287 S288 של PrrC הוכנה תת-ספריית מוטציות המייצגות את כל הקודונים האפשריים ע"י שימוש בתערובות מתאימות של אוליגונוקלאוטידים נרדפים (degenerate) שכ"א מכילה תחת שלשת בסיסי הקודון הנבחר תערובת שוויונית של ארבעת הנוקלאוטידים בכל עמדה (פריימרים מס' 5,6,7, ראה 2.4). מרבית המוטציות שנבדקו התקבלו מהספריות הללו אולם המוטציות D287F, D287H נוצרו במכוון בשיבוט נפרד בו השתמשתי באוליגונוקלאוטידים מוטגניים ייחודיים מתאימים (פריימרים מס' 8,9 ראה 2.4). בכל השיבוטים האלה הכיל האוליגונוקלאוטיד נושא המוטציות גם אתר Kpn I לצורך השיבוט. במקביל הונדס אתר KpnI בין שיירי PrrC 278-9. האוליגונוקלאוטיד השני ששימש בראקציית ה PCR היה פריימר מס' 4 (ראה 2.4), ובו אתר BamH I ששימש אף הוא לשיבוט המקטעים המתקבלים לפלסמיד.pRRC11 2.5.9 סלקציה לאבדן רעילות תלויית אק"נ הפלסמיד prrc11 ונגזרותיו מכילים את מסגרת הקריאה של PrrC תחת בקרת הפרומוטר המשולב T7-Lac שהפעלתו דורשת מצידה הפעלת ביטוי של הרנ"א פולימראז המתאים של פאג' T7 וכן דה-רפרסית האופרטור ע"י המשרן IPTG (יש לציין כי הפלסמיד מקודד גם 20

ש 3 ע) למוטנט של רפרסור הלקטוז.(LacI q כמו כן כפוף PrrC בפלסמידים אלה לתיבת בקרת תרגום חזקה של הפאג'. מסיבה זו די בדה-רפרסיה ע"י IPTG בכמות שיורית של רנ"א פולימראז של T7 כדי לקטול את החיידק. הסלקציה נערכה איפוא על גבי צלחות LB שהכילו, בנוסף לאנטיביוטיקה המתאימה גם 1. mm IPTG החיידקים הודגרו למשך לילה ב 30 C. כאמור, בתנאים אלה חיידקים הנושאים את הפלסמיד prrc11 או נגזרות בעלות פעילות דומה לגזע הבר אינם גדלים ואלה ששורדים מכילים נגזרות פעילות חלקית או לא פעילות של.PrrC 2.5.10 זיהוי סוגי trna הנבקעים ע"י אק"נ סוגי ה trna שנבקעו זוהו במבחן הכלאה של הפרגמנטים ה-' התקבלו מהם ל dot blots של רצפים קומפלימנטרים ששימש כגלאים. הפרגמנטים סומנו כמתואר בסעיף 2.5.2, הופרדו ע"ג ג'ל פוליאקרילאמיד ומוצו מתוך הג'ל (ראה סעיף 2.5.11). בניסיונות הראשונים שבוצעו שימשו כגלאים שבטי פאג' λ המייצגים את כל הגנים ל trna בחיידק. מקור שבטים אלו בספריה של.(Kohara et al., 1987) E. coli לפאג'ים הוסף NaOH לריכוז.dsDNA לשחרור ודנטורציה של ה 0.25 M לאחר מכן נספחו 3 µl מכ"א מסוגי ה DNA ng) 1-2) לגיליון ניטרוצלולוז. בניסיונות בהם לא היותה כמות הפרגמנטים גורם מגביל (לפחות 5000) cpm נעשה שימוש בכל 40 השבטים שבספריה. בניסיונות בהם לא הייתה כמות פרגמנטים מספקת, וכן בניסיונות מאוחרים יותר שנעשו כאשר סוגי ה trna העשויים לשמש סובסטרט לאק"נ כבר היו ידועים, נעשה שימוש בגיליונות קטנים יותר ועליהם 6-10 שבטים שכללו את סובסטרטים נבחרים ושבט או שניים נוספים כביקורת. בשלב מאוחר יותר הוכנס שיפור לשיטה, כאשר את שבטי הפאג' החליפו אוליגונוקלאוטידים סינתטים קומפלימנטרים לבסיסים 34-73 של 8/10 סוגי trna נבחרים. השימוש באוליגונוקלאוטידים אפשר שימוש בכמות זהה של גלאים ושמירה על תנאים אחידים. Nytran Super Charge מכ"א מהאוליגונוקלאוטידים נקשרו לגיליון ניילון מסוג 100 pmol " הקרנה ב 254 nm למשך 4 דקות. (חברת Schleicher & Schuell בכל המקרים נחסם הגיליון לאחר קישור הגלאים בעזרת בופר חסימה (ראה רשימת בופרים) ע"י הדגרה תוך 21

טלטול ב 42 C למשך שעה עד לילה. פרגמנטי ה trna הוספו בתוך בופר החסימה בתוספת 1% PEG 20,000 והודגרו עם הגלאים למשך שעתיים עד לילה תוך טלטול ב 42 C. לאחר מכן נשטפו הגיליונות ב 6xSSC ולפי הצורך ב,2xSSC נעטפו בסרן ונחשפו לסרט צילום Biomax MS ב 70 C- עם מסך הגברה. 2.5.11 מיצוי פרגמנטי trna מג'ל פוליאקרילאמיד פיסות פוליאקרילאמיד מכילות trna נחתכו מתוך הג'ל, נכתשו בהומוגנייזר והושרו למשך שעה ב 37 C בבופר 0.3 M ;0.2% SDS אצטט ph5.5 תוך כדי וורטקס. לאחר מכן הוסף לדגימה בהתאם לנפח 10-20 µg Carrier trna/dna ונפח אחד של פנול וההשריה נמשכה עוד 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי וורטקס. בתום ההשריה הדגימות סורכזו 5 דקות בצנטריפוגה שולחנית במהירות מקסימלית, הפאזה המימית הופרדה ועברה שיקוע אתנולי ולאחריו שטיפה אתנולית. הפלט שימש לניסיונות הכלאה (סעיף 2.5.10) או זיהוי קבוצת הקצה (סעיף 2.5.12). 2.5.12 זיהוי קבוצות קצה `5 של מקטעי RNA תוצרי האק"נ תערובות ריאקצית עיכול ה (5 µl) RNA הכילו: 10-20 µg,200-2,000 cpm trna 50 mm אצטט ph5.5 ו- 0.1 µg ריבונוקלאז.P1 תערובות הריאקציה,carrier trna הודגרו ב 37 C לשעתיים, יובשו והורחפו ב 1-5 µl מים עם עקבות.Xylene cyanol trna מסומן באופן אחיד עוכל לקבלת נוקלאוטידים ששימשו כסמנים. הרצה בכרומטוגרפיית שכבה דקה דו מימדית (1979 al., (Raba et בוצעה על לוחות צלולוז.(Macherery & Nagel) Polygram CEL 300 UV 254 נוזל ההרצה במימד הראשון היה 5:3 הוטענו דגימות של 0.5-5 µl (דגימה אחת על כל לוח).iso-butyric acid : 0.5 M NH 4 OH מתערובות הריאקציה, בהעדר או בתוספת 0.5 µl מתמיסת הסמנים. לאחר הרצה של כשעה הונחו הלוחות ליבוש. נוזל ההרצה במימד השני היה 70:15:15 22

.isopropanol : HCl : H 2 O לאחר הרצה של כשעה וחצי וייבוש נעטפו הלוחות בסרן והועברו לאוטורדיוגרפיה. זו בוצעה ב 70 C- עם מסך הגברה וסרט צילום.Biomax MS זהותם של הנוקלאוטידים נקבעה בהשוואה לתבנית הנדידה של ה 3 -NTPs המתאימים המתוארת ב (1979.(Nishimura, 2.5.13 עיבוד נתונים ממוחשב רצפים הומולוגים אותרו במאגרי הנתונים בעזרת התוכנה,(Altschul et al., (1997 BLAST באתר של National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast כנגד ה NonRedundant database וכנגד ה.Finished and unfinished Microbial Genomes מוטיב ה DA box-like זוהה ב Profilescan server של Swiss Institute for ) ISREC,(Experimental Cancer Research באתר.www.isrec.isb-sib.ch/software אין באתר הפניה למקור ספרותי..(Garnier et al., 1996) חיזוי מבנה שניוני בוצע בעזרת התוכנה GOR IV השוואת זוגות רצפים בוצעה בעזרת התוכנה,BESTFIT השוואת רצפים מרובים בוצעה על בסיס התוכנה PILEUP וקביעת אחוז ה G+C נעשתה בעזרת התוכנה,WINDOW שלושתן מחבילת התוכנה.(Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin) GCG 2.6 שיטות כלליות 2.6.1 אלקטרופורזת גל הפרדת חלבונים ב SDS-PAGE בוצעה כמתואר ב( 1989 al.,.(sambrook et גל ההרצה (Bio-Rad) Mini Protean היה בצפיפות 10% פוליאקרילאמיד. הרצה אופיינית במכשיר נמשכה כ 20 דקות במתח 80-100 V בשלב ה Stacking וכשעה במתח 120-180, V בשלב ההפרדה. 23

ג( הפרדת RNA באלקטרופורזה דנטורטיבית בוצעה בג'ל פוליאקרילאמיד- 7 M אוראה ברזולוציה גבוהה (ג'ל 22% פוליאקרילאמיד באורך 20 ס"מ בבופר (TBE x 1 או רגילה 'ל 15% פוליאקרילאמיד באורך 12 ס"מ בבופר.(TBE x 0.25 הרצה אופיינית בשדה של 40 V/cm נמשכה כשעה וחצי על ג'ל קצר וכשלוש שעות על ג'ל ארוך, או כ 16 שעות בשדה של 7.5 V/cm על ג'ל ארוך. Western Blotting 2.6.2 העברה חשמלית של חלבונים מג'ל לניטרוצלולוז התבצעה במתקן (LKB) NOVA- BLOT בזרם של.0.8-1 ma/cm 2 לאחריה נחסם גליון הניטרוצלולוז ע"י הדגרה של 2-16 שעות בחלב עמיד מכיל 1% שומן. לאחר מכן נשטף בבופר TBS-T והודגר למשך כ 16 שעות עם סרום הנוגדנים הראשוניים או נוגדנים ראשוניים מנוקים מהולים ב 1%. BSA + PBS בתום הדגרה זו נשטף הניטרוצלולוז ב TBS-T והודגר במשך שעתיים עם נוגדן שניוני (עז-נגד- ארנבת מצומד לפראוקסידאז) מתוצרת חברת Jackson מהול 1:15,000 בחלב עמיד כנ"ל. לאחר ההדגרה נשטף הניטרוצלולוז בבופר.TBS-T ראקציית ה ECL בוצעה עפ"י הוראות היצרן. PCR 2.6.3 20-100 ng בוצע בדומה למתואר ב( 1989 al., (Sambrook et. תערובת הריאקציה הכילה תבנית DNA ו 100 pmol מכל פריימר. ריכוז ה dntp s היה 0.2. mm הריאקציה בוצעה במכשיר של חברת Hybaid או במכשיר של חברת Eppendorf (עם מכסה מתחמם). הרצה אופיינית נמשכה 40 מחזורים, כאשר במכשיר של חברת Hybaid האנזים מוסף בתום המחזור הראשון שנמשך 7 דקות ב 95 C. המחזורים הבאים היו של: דקה ב 3 55 C, דקות המחזור האחרון היה של 10 דקות ב 72 C. תערובת הריאקציה ב 72 C, דקה ב 94 C. כוסתה ב 100 µl שמן פרפין. בהרצה במכשיר מתוצרת חברת Eppendorf קוצרו זמני 24

השלבים כדלהלן: המחזור הראשון נמשך 5 דקות ב 95 C. המחזורים הבאים היו של: 20 שניות ב 55 C, דקה ב 72 C, ו 20 שניות ב 94 C. המחזור האחרון היה של 7 דקות ב 72 C 2.6.4 קביעת רצף RNA בוצע כמתואר ב 1979) al.,.(silberklang et 2.6.5 הפרדת מקטעי DNA על גל אגרוז והפקתם מהגל בוצעו כמתואר ב( 1989 al.,.(sambrook et 2.6.6 טרנספורמציה לתאי E. coli בוצעה באמצעות אלקטרופורציה כמתואר ב (1990 Jesse, (Smith and במכשיר מתוצרת חברת Bio-Rad או במכשיר מתוצרת חברת.EC 2.6.7 קביעת רצף DNA מרבית הרצפים נקבעו אוטומטית במכשיר ABI PRISM Dye Terminator Cycle Dideoxy chain מקצת הרצפים נקבעו ידנית בשיטת.Sequencing (Perkin Elmer) USB של חברת Sequenase version II בעזרת קיט,(Sanger et al., 1977) עפ"י termination לפי הוראות היצרן. 2.7 רשימת בופרים.(Sambrook et al., 1989) של Appendix B כמתואר ב הוכנו ו- TBE TBS,SSC,PBS.0.5% בתוספת Tween 20 TBS :TBS-T בופר חסימה לגיליונות dot blots לזיהוי 6xSSC; 5x Denhardt`s reagent; 0.5% :trna.sds; 100 µg/ml denatured Salmon sperm DNA; 50% formamid 25

2.8 רשימת מצעי גידול לחיידקים.(Sambrook et al., 1989) של Appendix A כמתואר ב הוכנו ו- TB LB.(Miller, (1992 הוכן כמתואר ב Trypton LP יש להמיס 12.1 gr Trizma base; 1 gr NH 4 Cl; 1.5 gr KCl; 5 gr NaCl ב 1 ליטר מים (נפח סופי) ולטטר ב HCl ל.pH=7.4,1 mm MgSO 4,0.4% Glucose,10% Bacto peptone בתוספת LP מועשר הוכן מבופר LP 0.1 mm Na 2 HPO 4 ו-.0.01 mm CaCl 2 (בעבודה זו לא הוסף Tryptophan ל LP מועשר). 26

תוצאות.3 Lys 3.1 זיהוי אתר PrrC המעורב בהכרת האנטיקודון של trna חוסר היכולת לנקות את PrrC בצורה פעילה עקב הקושי לבטאו ביתר ואי יציבותו הגבילו את היכולת לבצע מחקר ביוכימי ישיר של החלבון. בשל כך התרכזתי בניסיון לאפיין את PrrC בשיטות גנטיות. בשלב ראשון פניתי למוטגנזת חסרים. 3.1.1 מוטגנזת חסרים עפ"י השערת העבודה שנומקה בפרק המבוא שוכנת פעילות האנטיקודון נוקלאז בחלק הקרבוקסילי של,PrrC בעוד האזור האמיני מכיל אתר קישור נוקלאוטיד אשר אחראי לזיקה הממסכת ההפיכה עם אנזים ההגבלה.EcoprrI בהשערה המקורית היה גודלו של האזור האמיני כ 200 שיירים. בהתאם לכך, ומתוך מטרה למצוא קטע חלבון מינימלי בעל פעילות ליבת אנטיקודון נוקלאז, בוצעה מוטגנזת חוסרים בה הושמטו קטעים באורכים שונים מהחלק האמיני של החלבון. בעבר נמצא כי מוטנטי חסר בעלי השמטות קצרות מהקצה האמיני, ביניהם אחד שחסר ששה שיירים בלבד, לא הראו כל פעילות אנטיקודון נוקלאז (אילן מורד, תקשורת אישית). לתוצאות אלה ניתן להציע שני הסברים: (1) החומצות האמיניות הראשונות בחלבון חיוניות במישרין או בעקיפין לפעילות האנטיקודון נוקלאז; (2) בנוסף, או לחלופין, האזור האמיני הקטום אינו מתקפל כהלכה ובכך מערער את מבנה שאר החלבון. בהסכמה עם האפשרות השניה היו החלבונים המוטנטיים בלתי מסיסים ונמצאו בגופיפי הכללה bodies).(inclusion בכדי להמשיך ולבחון שאלות אלו ולנסות להשמיט בכל זאת חלקים מיותרים להכרות וביקוע trna Lys יצרתי שלושה גזעים בעלי חסרים פנימיים בין השיירים ;76-157 95-186 ;48-200 ושניים נוספים בהם בוצעו השמטות של חלקים גדולים של האזור האמיני מתחילתו (1-199 ;1-155) (תמונה 3.1). בכל חמשת המקרים לא נצפתה פעילות אנטיקודון נוקלאז במבדק in vivo (שיטות). 27

מוטנטי חסר של.PrrC מלבנים שחורים מציינים רצפי.PrrC מלבנים אפורים בשלושה תמונה 3.1: מהמוטנטים מציינים קטע של ששה שיירים ראשונים של תוצר גן 10 של פאג' (T7gp10) T7 שהקטע המקודד להם מהווה גם חלק מאזור בקרת התרגום. קטע זה אינו מבטל את הפעילות. in vivo לאור תוצאות אלה הנחתי כי לאזור האמיני, או לחלקים ממנו, עשוי בכל זאת להיות תפקיד חיוני לפעילות האק"נ. השערה זו נתמכת בתוצאות המוטגנזה האקראית באזור זה, שגילו מוטציות נקודתיות שפגעו בפעילות האק"נ ((1999 ;(Rozner, ופרק 3.3). מאידך גיסא, לאור חוסר יציבות החלבון המקורי, לא ניתן לשלול את האפשרות כי כל מוטציות החסר גרמו לפגיעה במבנה החלבון. ידועים מקרים של אזורים (domains) שלא התקפלו כהלכה ופגעו בפונקציות של אזורים שכנים. לעתים די בחילוף חומצה אמינית יחידה באזור אחד כדי לגרום לכך (1999 al.,.(kesti et מאידך, לאור "שיערוך" האזור האמיני קושר הנוקלאוטיד אשר משתרע על פי אומדן נוכחי בין שיירים 1-250 לערך (ראה בהמשך התוצאות ובדיון), ייתכן שהשמטת קטע גדול יותר תאפשר את החילוץ המבוקש של אק"נ מינימלי. 3.1.2 מוטגנזה איזורית וסלקציה לפגיעה בפעילות אק"נ מאחר וכל מוטנטי החסר לא היו פעילים, עברתי למוטגנזה נקודתית. מכיוון שתכליתו המוצהרת של המחקר הייתה למקם את האתר הפעיל של החלבון, פתחתי במוטגנזה אקראית שלאחריה ברירת מוטנטים שפעילות האנטיקודון נוקלאז שלהם נפגעה. לצורך הסלקציה ניצלתי את הפנוטיפ הטוקסי המתקבל כאשר PrrC מבוטא תחת בקרת שעתוק ובקרת תרגום נמרצים של פאג' T7 (פלסמיד.((Meidler et al., (1999,pRRC11 אציין כאן כי ביטוי הגן מאזור בקרת התרגום המקורי החלש (פלסמיד ((Morad et al., (1993,pRRC6 אינו מפריע לגידול החיידק. כנראה שבתנאים אלה מספיק קצב שעתוק ועיבוד trna Lys לפצות על אבדן המולקולות המבוקעות. לצורך יצירת ספריות מוטנטים סונתזו מקטעים 28

שונים של הגן בשיטת PCR בתנאים בהם הצטברו מוטציות אקראיות בשעור ניכר (כ 0.25 מוטציות בממוצע למולקולת.(DNA קטעים סינתטיים אלה החליפו את קטעי הבר המקוריים ב-.pRRC11 בשלב ראשון בוצעה אנליזה של המקטע שבין חומצות אמינו 200-313. מקטע זה נבחר בהתאם להשערה כי גודלו של האזור האמיני כ 200 חומצות אמינו, ופעילות קישור וחיתוך הסובסטרט צפויות להמצא מעבר לאזור זה. כמו כן, גודלו של הקטע התאים לטווח קביעת רצף DNA בתנאים דאז. ספריית מוטנטים שהתקבלה באופן זה הוחדרה לחיידקים שנזרעו על מצע גידול בנוכחות המשרן IPTG המפעיל בעקיפין את ביטוי האק"נ. שרדו בתנאי סלקציה אלו, הקטלניים לגזע הבר. רק פרטים שפעילות האק"נ שלהם נפגעה המושבות ששרדו נאספו ואופיינו על פי מספר מאפיינים. כך, בסבב המוטגנזה הראשון בו נבדק הקטע 200-313 נאספו 88 מוטנטים ששרדו את הסלקציה. 55 מתוכם בטאו חלבון דמוי PrrC שהיה ב 44 מקרים בגודל מלא. המוטנטים הנותרים הכילו במקרים שנבדקו מוטציות.frame-shift במוטנטים בהם לא זוהה חלבון לא נמצאה מוטציה בקטע הרלבנטי. 3.1.3 זיהוי צבר מוטציות הפוגעות בפעילות האק"נ ל 30 מהמוטנטים בקטע 200-313 שקודדו לחלבונים באורך מלא (אחדים מהם מוצגים בתמונה 3.2) נקבע רצף ה.DNA מתוכם 19 הכילו מוטציה נקודתית יחידה, לשאר היו מוטציות כפולות. חלק מהמוטציות חזרו שלש פעמים (טבלה 3.2). בסך הכל נמצאו 13 (6/13) מוטציות נקודתיות שונות. פיזורן של מוטציות אלו לא היה אקראי. כמחצית התמפו בין שיירים 287 ו- 303, בצפיפות גבוהה פי שלוש מהממוצע. בהמשך נבדקה פעילות אק"נ in vivo של כל המוטנטים היחידאיים וחלק מהמוטנטים הכפולים. התוצאות עבור חלקם מוצגות בתמונה 3.3 ומסוכמות בטבלה 3.2. נמצא כי לכל המוטנטים הכפולים שנבדקו וכן לאותם מוטנטים יחידאיים חוזרניים לא הייתה פעילות אק"נ ניתנת לזיהוי (לדוגמא המוטנט,L259P תמונה 3.3 ערוץ 3). לעומתם, מרבית 29

המוטנטים היחידאיים שנבררו פעם אחת היו בעלי פעילות אק"נ חלקית (תמונה 3 ערוצים 4,5,7,9,10). ממצא זה רומז כי למוטציות החוזרניות חסרות הפעילות היה יתרון סלקטיבי. הופעתן החוזרת של חלק מהמוטציות, כמו גם השיעור הגבוה יחסית של מוטציות כפולות מרמזים כי שיעור ניכר מהמוטציות היחידאיות שנוצרו היו חסרות פנוטיפ בר גילוי. נשקלה גם אפשרות כי התפלגות זו נבעה ולו בחלקה בשל יצירת אחדות מהמוטציות בשלבים מוקדמים יחסית של ראקצית ה,PCR אולם לאפשרות סבירות נמוכה בשל חזרה בלתי תלויה של מוטציות בלתי פעילות בהפקות PCR נוספות המתוארות בהמשך. פעילותם היחסית של המוטנטים השונים הוערכה על סמך הכמות היחסית של תוצרי חיתוך האק"נ.in vivo נמצא כי לרוב המוטנטים הייתה פעילות מוחלשת שנעה מרמה קרובה לזו של גזע הבר ועד לפעילות בגבול יכולת הזיהוי (תמונה 3.3). פעילותם הסגולית של החלבונים המוטנטיים עשויה להיות נמוכה מזו המוערכת על פי הכמות היחסית של תוצרי הראקציה שכן החלבונים המוטנטיים הצטברו בכמויות גדולות בהרבה מאלו של האק"נ הטבעי שרמתו הייתה נמוכה עד כדי שני סדרי גודל למרות מערכות הביטוי החזקות (תמונה 3.2). סיבת הדבר נעוצה כנראה בנזק הנגרם למנגנון התרגום התאי כתוצאה מפעילות האק"נ ובכלל זה לתרגום האק"נ עצמו. בהתאמה לסברה זו נמצא יחס הפוך בין רמת הפעילות לכמות החלבון המצטברת בתא שנקבעה בקומסי וב-.Western blot בתמונה 3.2 אפשר להתרשם מכך שחלבון גזע הבר הצטבר בכמות הקטנה ביותר, החלבון המוטנטי I227T בעל הפעילות הגבוהה יחסית לשאר המוטנטים (אך נמוכה מגזע הבר) הצטבר בכמות בינונית, גדולה פי 20 לערך, ואילו מוטנטים פחות פעילים או חסרי פעילות הצטברו בכמות גדולה לפחות פי 50. 30

רמות ביטוי חלבון באללים שונים של.PrrC האללים המצויינים של PrrC בוטאו ביתר מתוך תמונה 3.2: פלסמידpRRC11 ונגזרותיו המוטנטיות. החלבונים זוהו ב Western blot ע"י נוגדן שנוצר כנגד חלבון קטוע ;D287Y -5 ;D222E -4 ;I227T -3 גזע הבר; PrrC -2 ונוקה ע"ג האנטיגן. ערוצים: -1 וקטור; PrrC 50-396.L259P -7 ;F292S -6 של אללים שונים של.PrrC גזעי PrrC המצוינים בוטאו כבתמונה פעילות ליבת אק"ננננ in vivo תמונה 3.3: 3.2 ואפיון מקטעי ה RNA הנוצרים בתא בעקבות פעולת האנזים נעשה כמתואר בשיטות. ערוצים: -1 גזע הבר; -2 וקטור; -3 ;L259P ;D223G,S293P -8 ;V258E -7 ;F292S -6 ;D287Y -5 ;D222E -4.I227T -10 ;S288P -9 31

כאשר נבדקה פעילותם של חלק מהחלבונים המוטנטים in vitro נמצא כי חלבונים מוטנטיים בעלי פעילות חלשה in vivo שהצטברו בתאים בכמויות גדולות גילו פעילות גבוהה במבחנה מזו של גזע הבר. נראה כי ריכוזו הגבוה של החלבון תורם ליציבות באופן שעשוי לפצות על הירידה ברמת הפעילות האינטרינזית. כך, למרות שפעילות המוטנט D222E נמוכה in vivo במידה רבה מזו של גזע הבר (תמונה 3.3, השווה ערוצים 1 ו- 4), מידת הפעילות in vitro גבוהה משמעותית מזו של גזע הבר (תמונה 3.4, השווה ערוצים 2 ו- 3). תופעה דומה נמצאה לגבי המוטנט.K266E מוטנטים נקודתיים כאלה עשויים להקל על חקירת האנזים.in vitro של אללים שונים של.PrrC תמציות 30-S מתאי K-38:pGP1-2 מבטאי פעילות in vitro 3.4: תמונה (שיטות). לאחר הביקוע נותר הסימון האללים המצוינים של PrrC הודגרו עם trna Lys שסומן בפוספט 32 P בפרגמנט ה `5 (<1-33P). 32

ע 5 3.1.4 ביטוי ביתר של PrrC גורם לביקוע סוגי trna נוספים כאשר מבוטא PrrC בקונטקסט הטבעי שלו, ברמה נמוכה ובנוכחות,EcoprrI הוא בוקע trna Lys בלבד. שני הפרגמנטים המתקבלים, באורך 43 ו 33 בסיסים, מתגלים כאשר ה RNA התאי ממוצה ומופרד בתנאי דנטורציה על ג'ל פוליאקריל-אוראה al., (Amitsur et (1987. תבנית תוצרים דומה התקבלה כאשר נבחנו מספר מוטנטים בעלי פעילות אק"נ חלקית (תמונה 3.3, ערוצים 4,7). לעומת זאת, גזע הבר המבוטא באותו הקונטקסט (מפלסמיד (prrc11 יצר כמות ניכרת של תוצרי ביקוע נוספים אשר נדדו מעט מעל לפסים הרגילים (ערוץ 1). גם מוטנטים בעלי פעילות גבוהה (למשל (I227T יצרו את התוצרים הנוספים הללו אך בכמות קטנה יותר (ערוץ 10). הופעת פסים נוספים אלו רמזה כי הספציפיות של PrrC מתרופפת כאשר הוא מבוטא ביתר, כנראה בשל ריווי הסובסטראט הטבעי ע"י עודף מולקולות.PrrC כלומר, בתנאים אלו עשויים להתקף גם סובסטרטים משניים בעלי אפיניות נמוכה יותר לאנזים. כאן המקום לציין כי שני מוטנטים, D287Y הניבו תבנית חיתוך יוצאת דופן (ערוצים 5,9). תבנית זו הייתה שונה מהתבנית ו,S288P הרגילה ומתבנית "פעילות היתר" של גזע הבר ומוטנטים אחרים. תאור תבניות חורגות אלה ומשמעותן תידון בהמשך בסעיף נפרד. בכדי לבחון אם אמנם נבקעים סוגי trna נוספים כאשר האנזים מבוטא ביתר, הפקתי את מקטעי החיתוך הגדולים מצד 3 של נקודת הביקוע, 43 בסיסים במקרה של,tRNA Lys וסימנתי את קצוות ה -OH "י פולינוקלאוטיד-קינאז. קצוות אלה מסתמנים ישירות ע"י הקינאז וזמינים יותר מקצוות P- 5 של מולקולות לא בקועות המסתמנים בראקצית השחלוף האיטית. תוצרי פעילות אק"נ המסומנים זוהו על גבי רקע חלש של שברים לא ספציפיים הנוצרים ללא אק"נ (תמונה 3.5, פאנל a). לצורך הפרדה טובה יותר של תוצרים אלה הופעלו תנאי אלקטרופורזה שונים (תמונה 3.5, פאנל b). הפסים השונים שהתקבלו נחתכו מהג'ל ומקטעי ה trna מוצו מתוכם ואופיינו כמתואר בהמשך. באופן זו תועדו תוצרי חיתוך של אללים שונים של PrrC בעלי מגוון רמות פעילות וכן שני המוטנטים בעלי תבניות החיתוך יוצאות הדופן. מוטנטים בעלי פעילות אק"נ חלשה יחסית (בהסתמך על 33

בדיקת הפעילות לאחר סימון (in vivo בקעו בעיקר trna Lys (תמונה 3.5, פאנל b, פס a בערוצים 4,5) ורק כמויות זעירות של סוגים נוספים (פסים.(b-d אולם עם העלייה בפעילות אק"נ החל לעלות שיעורם היחסי של פסים b-d המכילים את אותם סוגים נוספים. מכך אפשר להתרשם כאשר בוחנים דגם חיתוך של גזע הבר המבוטא ברמה בינונית (ערוץ 6) ומוטנט פעיל ביותר המבוטא ברמה הגבוהה (ערוץ 7) ולבסוף, של גזע הבר המבוטא ברמה הגבוהה (ערוץ 8). כלומר, עליה ברמת הפעילות של PrrC לוותה בהתרופפות הספציפיות ל.tRNA Lys כצפוי, תבנית החיתוך של D287Y ו S288P הייתה שונה גם בבדיקה זו מזו של גזע הבר והמוטנטים האחרים. בתא. RNA נמוך מולקולרי מוצה אק"נ פעילות ע"י שנוצרו ע סימון במבחנה של מקטעי RNA תמונה 3.5: מתאים המבטאים את אללי PrrC המצוינים (או וקטור). ה RNA סומן לאחר מכן בקצה ה - 5 ע"י פולינוקלאוטיד-קינאז. התוצרים הופרדו באלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילאמיד 15% (פאנל a) או 22% (פאנל b) בנוכחות 7 M אוראה (שיטות). הקידומות -6 ו -11 מציינות את הקונטקסט הפלסמידי: prrc6 או.tRNA Lys מכילים בעיקר פרגמנט 34-76 של a בהתאמה. הפסים המסומנים ב,pRRC11 תוצרי החיתוך זוהו ע"י היברידיזציית Dot Blot ל DNA של שבטי פאג' λ רקומביננטיים בעלי מחדרים המייצגים את כלל צברי הגנים ל trna ב.E coli (שיטות). דוגמאות לתוצאות מבדקי היברידיזציה כאלה מוצגות בתמונה 3.6. כצפוי, תוצר החיתוך של אק"נ לטנטי שהופעל לאחר הדבקה בפאג' - pnk T4 הדליק רק את שבטי λ המקודדים ל trna Lys ובעוצמות יחסיות המתאימות למספר עותקי הגן בשבט הנתון (תמונה 3.6, פאנל a). ביטוי 34

ביתר של מוטנט אק"נ בעל הפעילות הגבוהה ביותר I227T עדיין גרם בעיקר לביקוע trna Lys (פאנל b). (פאנל c). אך במקרה זה הראתה ההכלאה תוצרים נוספים שמקורם בסוגי trna אחרים חלקם היחסי של סוגים אלה עלה במידה ניכרת כאשר PrrC גזע הבר בוטא ביתר את הסובסטרטים הנוספים שנבקעו ניתן היה לזהות במרבית המקרים ישירות מתבנית ההיברידיזציה שהתקבלה. כך, שבטים 14 ו Asn-Asn-Asn) 15 (Ser 2 -Asn, מצביעים על trna Asn כסובסטרט נוסף עיקרי. trna Ser2 אינו בא בחשבון שכן יש לו זרוע וריאבילית גדולה ועל כן אילו נחתך בלולאת האנטיקודון היה מתקבל תוצר גדול מאלה שסומנו ונלקחו למבדק ההכלאה. באופן דומה הסיגנל המתקבל משבט 22 מתאים ל trna Arg וסיגנלים אחרים מצביעים על.tRNA Glu הפרגמנטים שהוכלאו לשבט -) 6 3 Leu (Met m -Gln 1 -Gln 2 זוהו בעזרת קביעת רצף כנובעים משני סוגי ה.tRNA Gln אם כן, ביטוי ביתר של PrrC גורם לביקוע סוגי trna נוספים לסובסטרט הטבעי.tRNA Lys 35

שבטי פאג' למבדא רקומביננטים מקודדי גנים של.E coli trna ששימשו כגלאים Clone a trna encoded b Clone trnas encoded 01/124 Ile 1 -Ala 1B -Asp 1 (rrnh) 21/441 Ile 2 02/125 Asp 1 22/446 Ser 3 -Arg 2 -Arg 2 -Arg 2 -Arg 2 03/128 Thr 2 23/458 Met f -Met f -Met f 04/136 A pseudo trna 24/464 Gly 1 05/158 Arg 4 25/476 Phe 06/171 Leu 3 -Met m -Gln 1 -Gln 2 26/510 Ile 2 07/179 Val 1 -Lys-Lys-Val 1 -Lys-Lys-Lys 27/520 Met f2, Leu 2 08/213 Ser 5 28/521 Leu 2 09/223 Ser 1 29/531 Glu 2...Thr 1 (rrnd/rrne) 10/230 Ser 5 30/534 Glu 2 (rrnb) Thr 4 -Tyr 2 -Gly 2 -Thr 3 11/249 Tyr 1 -Tyr 1 31/548 Ile 1 -Ala 1b (rrna) 12/319 Val 2B -Val 2A 32/554 Arg 3 -His-Leu 1 -Pro 3 13/341 Gly 3 -Cys 33/557 Glu 2...Asp 1 -Trp(rrnC) 14/345 Ser 2 -Asn 34/570 SelC 15/346 Asn, Asn, Asn 35/602 Pro 1 16/371 Pro 2 36/629 Ile 1 -Ala 1B (rrnd/rrne) 17/410 Arg 5 37/647 Phe 18/417 Ala 2 -Ala 2, Val 1 -Val 1 -Val 1 -Lys 38/652 Gly 3 -Gly 3 -Gly 3 19/436 Glu 2 (rrng) 39/660 Leu 6 20/439 10Sa RNA 40/673 Leu 1 -Leu 1 -Leu 1 a המספרים הרצים משמאל לקו הנטוי מציינים את המיקום ב,blot בעוד שהמספרים מימין לקו הנטוי (1987 al.,.(kohara et מציינים את מספר השבט כפי שפורסם ב.(Komine et al., 1990) זהות השבטים נקבעה ע"י b לגנים של RNA.tRNA נמוך משקל מולקולרי מוצה י ההכלאה תוצרי חיתוך אק"נ ע עע"""" זיהוי תמונה 3.6: מהתאים המצוינים וסומן in vitro בקצה ה - 5 ע"י פולינוקלאוטיד-קינאז כמתואר בתמונה 3.5. התוצרים מוצו מהג'ל והוכלאו ל dot blot של שבטי פאג' למבדא מקודדים לכל הגנים ל trna מ.E coli כמפורט בטבלה..(pnk ב (פגוע T4 pset 1 שהודבקו בפאג' (prr +, (Depew and Cozzarelli, 1974)) E. coli CTr5X תאי :a.dot blot מטריצת ה :d.e. coli K-38:pGP1-2:pRRC11 :c.e. coli K-38:pGP1-2:pRRC11-I227T :b 36

3.1.5 שתי מוטציות סמוכות משנות מהותית את סגוליות החיתוך של אק"נ כפי שהוזכר לעיל המוטציות D287Y ו S288P גרמו לפנוטיפ חיתוך שונה מזה של גזע הבר ויתר המוטנטים. פנוטיפ זה וסמיכות המוטציות עשוי להצביע על כך שאתר המשפיע על אופי האינטראקציה בין PrrC לסובסטרט השתנה. כאשר בוחנים את תוצרי החיתוך של המוטנטים שסומנו in vivo (תמונה 3.3) נראה כי רק שני המוטנטים הללו יצרו תוצרים נוספים אשר נדדו בג'ל בין הפרגמנטים הרגילים (ערוצים 5,9). הופעתם של פסים הנודדים מתחת לפס הגבוה ומעל לפס הנמוך יכולה להיות מוסברת בחיתוך trna Lys או סוג trna אחר דומה בגודלו, שייר אחד או שניים במורד לעמדה הרגילה המצויה בין בסיסים 33 ל 34. הנחה זו אוששה ע"י זיהוי קבוצת הקצה ה 5 המסומנת של תוצרי חיתוך אינדיבידואליים שזהותם נקבעה קודם לכן ע"י היברידיזציה לשבטי הלמבדא הרקומביננטיים כנ"ל. קבוצות הקצה שוחררו ע"י עיכול ממצה בנוקלאז P1 אשר מפרק פולינוקלאוטידים לנוקלואוזידים `5 פוספאט ובהם זה המסומן מהקצה ה `5 (שיטות). תוצרי אללים שונים של אק"ננננ. מקטעי 3 שהתקבלו לאחר אפיון קבוצות קצה של מקטעי RNA תמונה 3.7: חיתוך ע"י אק"נ בתא וסומנו סימון קצה במבחנה (תמונה 3.5) מוצו מהפסים המצוינים בתמונה זו ועוכלו עיכול מלא ע"י ריבונוקלאז P1. לדגימות הוספה תערובת סמנים של ארבעת הנוקלאוטידים השכיחים בכמות כוללת (רדיואקטיביות) נמוכה פי 10 מזו של הדוגמא הנבדקת. הדגימות הופרדו וזוהו בכרומטוגרפיה דו מימדית (שיטות). האותיות הקטנות מימין לכתמים מציינות את הסמנים, האותיות הגדולות יותר משמאלם מציינות קבוצות קצה. 37

גזע הבר והמוטנטים בעלי תבנית החיתוך הרגילה (מיוצגים ע"י (I227T יצרו מקטעי בהתאמה) בעלי קבוצת הקצה U 8 b ו a,3.5 ערוץ 7 פסים (תמונה trna Glu ו trna Lys uridine) (5-methylaminomethyl-2-thio המתאימה לבסיס ה Wobble (תמונה 3.7, פאנל 7-[4,5-cisdihydroxy-1-) Q 3.5, ערוץ 7) שחררה (תמונה c תערובת מקטעים מפס.(A,B,cyclopenten-3yl amino methyl]-7-deaza-guanine בסיס ה Wobble של,(tRNA Asn כמות C). שמקורו לא ידוע (פאנל C ומעט (trna Arg של Wobble בסיס ה,Inosine) קטנה של I תבנית דומה התקבלה עם גזע הבר מבוטא מ.pRRC6 כלומר גזע הבר והמוטנטים בעלי הפנוטיפ הרגיל בקעו הן את trna Lys והן מספר סוגי trna אחרים מצד 5 של בסיס הפקפוק.(Wobble) D287Y התנהג אחרת. הוא בקע אמנם את הסובסטרט הטבעי באתר הרגיל אך לפחות שני סוגים אחרים נבקעו בסיס אחד או שניים במורד לאתר זה. כך, פרגמנט trna Lys שנוצר ע"י D287Y נדד כתוצר גזע הבר המקביל (תמונה 3.5, פסים a) וכמוהו שחרר U 8 (תמונה 3.7, פאנל D). תוצאה זו אוששה גם בניסוי in vitro בו נמצא ש trna Lys נבקע ע"י D287Y באתר הרגיל (תמונה 3.8). ראוי לציין כי פס a של D287Y שחרר גם C, שמקורו אולי ב.tRNA Gln2 לעומת זאת, D287Y יצר פרגמנט trna Glu (תמונה 3.5, ערוץ 9 פס e) שנדד מהר מהפס המקביל של גזע הבר (פס b) ושחרר את קבוצת הקצה D287Y ע"י trna Glu תוצאות אלה מעידות על חיתוך E). 3.7, פאנל (תמונה במקום U 8 U בהסטה של בסיס אחד במורד לאתר הרגיל שכן רצף האנטיקודון של סובסטראט זה הוא U. 8 UC זאת ועוד, פרגמנט ה trna Asn שנוצר ע"י,D287Y אשר נוקה בנפרד ואופיין ע"י היברידיזציה וריצוף הסתיים בעמדה 36 ובהתאמה שחרר את קבוצת הקצה U (תמונה 3.7, פאנל F). כלומר, D287Y בקע את trna Asn בהסטה של שני בסיסים במורד לאתר הרגיל. המוטנט S288P בקע את הסובסטרט הטבעי באתר הרגיל, אך לפחות סובסטרט אחד במורד לאתר זה. פרגמנט ה trna Lys ופרגמנט נוסף שנדד איתו, כנראה,tRNA Gln2 שנוצרו ע"י G) 3.7, פאנל (תמונה C ו שחררו את קבוצות הקצה U 8 a) 3.5, ערוץ 10 פס (תמונה S288P המתאימות לחיתוך הסובסטרטים בעמדה הרגילה. בניגוד לכך, הפרגמנט שהתקבל מחיתוך trna Glu ע"י S288P (המרכיב העיקרי של הפס הכפול f בתמונה 3.5, ערוץ 10), שחרר 38

תערובת של U ו C (תמונה 3.7, פאנל H) היכולים להתקבל מחיתוך 5 trna Glu לעמדה 35 ו 5 לעמדה 36. לחלופין, יתכן כי מקורה של קבוצת הקצה C בסוג אחר של trna שלא זוהה. י נגזרות S288P,D287Y PrrC ו-.I227T תמציות תאי של trna Lys ע"י ביקוע in vitro תמונה 3.8: (שיטות). לאחר 32 P שסומן בפוספט trna Lys הודגרו עם PrrC מבטאי האללים המצוינים של K-38:pGP1-2 הביקוע נותר הסימון בפרגמנט ה `5 (<1-33P). ערוצים :1&4,pRRC11-I227T ערוצים :2&5,pRRC11-S288P ערוצים :3&6.pRRC11-D287Y אם המוטציות D287Y ו S288P שינו באופן מהותי את אופן ביקוע הסובסטראט ע"י,PrrC הרי שהפנוטיפ שלהן צריך להתבטא מבלי שים לב לרמת הפעילות. ואכן, פנוטיפ החיתוך האופייני של S288P התגלה ברמת פעילות נמוכה מזו של מוטנטים שגילו ספציפיות גבוהה יותר, כמו D222E (תמונה 3.3, השווה ערוצים 4 ו 9). המוטנט D287Y שהיה פעיל הרבה יותר מ S288P הושווה לגזע הבר ולמוטנט אחר בעל פעילות גבוהה ותבנית חיתוך רגילה,,I227T במערכת הביטוי החלשה של prrc6 (תמונה 3.9, פאנל a). תוצרי החיתוך שהתקבלו במקרה זה אופיינו ע"י היברידיזציה למספר גלאים קטן מייצגי trna Glu (שתי trna Metf trna Asn נקודות),,tRNA Lys (נקודה מכ"א) וכן נקודה אחת לסוגים ו trna Gly שאינם אמורים להבקע ע"י האנזים. במקרה של D287Y הייתה עוצמת האותות 39

ל trna Glu ול trna Lys דומה והאות ל trna Asn חלש בהשוואה (תמונה 3.9, פאנל b). לעומת זאת,I227T בעל רמת הפעילות הדומה (תמונה 3.9, פאנל a) בקע בעיקר trna Lys ואח"כ trna Asn בעוד ש trna Glu זכה כאן לעדיפות נמוכה (תמונה 3.9, פאנל c). סדר דומה נמצא עבור גזע הבר, הפעיל יותר, שבוטא באותו קונטקסט של prrc6 (תמונה 3.9, פאנל d). אם כן, גם ברמת הביטוי הנמוכה לא העדיף D287Y את הסובסטרט הטבעי על פני סובסטרט משני, בניגוד לגזע הבר ולמוטנט אחר בעל פנוטיפ חיתוך נורמלי. יתר על כן, ל D287Y הייתה העדפה שונה לסובסטרטים משניים שכן הוא העדיף את trna Glu על פני trna Asn ולא להפך. גם סדר ההעדפה של הסובסטרטים המשניים של S288P (תמונה 3.3, ערוץ 9, תמונה 3.5, ערוץ 10) היה שונה מזה של גזע הבר ודמויי גזע הבר. ביטוי שונות. a: השוואת מקטעי 3 ברמות סדר העדפת סובסטרטים של אללים שונים של PrrC תמונה 3.9: שהתקבלו לאחר חיתוך in vivo וסומנו in vitro בקצה ה 5 (תמונה 3.5). המוטנטים D287Y ו- I277T בוטאו מנגזרות הפלסמיד prrc6 ו- D287Y גם מנגזרת של :b-d.prrc11 תוצרי אק"נ של האללים המצויינים הוכלאו במקובץ ל dot blot של שבטי פאג' למבדא המקודדים לקבוצת הגנים ל trna מ.E coli המצוינים במטריצה e (פרוט בתמונה 3.6). לסיכום פרק זה, שינוי הספציפיות לסובסטרט שהתבטאה בשינוי עמדת החיתוך ובשינוי סדר העדפת הסובסטרטים המשניים רמז על כך ששני השיירים שהותמרו קשורים בהכרת הסובסטרט, בייחוד הכרת איזור האנטיקודון בו. יתר על כן, סמיכותם של השיירים שהותמרו והעדר פנוטיפים נוספים מאותו טיפוס רמז על כך שהם שייכים לאתר המושתת על צבר מצומצם של חומצות אמיניות סמוכות. 40

3.2 מוטגנזה מוכוונת של האתר המשוער של הכרות הסובסטרט כדי לבחון את ההשערה ששיירי D287 PrrC ו S288 שייכים לאתר המזהה את האנטיקודון של trna Lys יצרתי מספר מוטציות מוכוונות בשתי עמדות אלו ובשייר השכן G286 ובדקתי את תכונותיהן. עיקר הנתונים שנאספו עד כה נוגעים לעמדה 287, שהמוטציה המקורית שנמצאה בה גרמה לשינוי המובהק ביותר בפנוטיפ החיתוך. מוטציות אלו נבררו מתוך "ספריות-כיס" שהכילו כ"א את כל החילופים האפשריים בכ"א משלש העמדות (שיטות). בסך הכל נבררו ונבדקו עד כה 11 מוטציות בעמדה 4 287, מוטציות בעמדה 288 ו 3 בעמדה.286 לצורך אפיון המוטנטים בדקתי מספר פרמטרים. ראשית, הפנוטיפ הלתלי הוערך עפ"י שעור המושבות השורדות לאחר השריית ביטוי PrrC בנוכחות.IPTG שנית, תוצרי החיתוך של המוטנטים זוהו, בנפרד או במקובץ, ע"י הכלאת פרגמנטים המתקבלים כתוצאה מפעולת PrrC בתא ומסומנים רדיואקטיבית בקצותיהם ל dot blot ובו אוליגונוקלאוטידים משלימים לבסיסים 34-73 של 10 סוגי.tRNA סוגים אלה כללו את הסובסטרטים של אק"נ, העיקרי והמשניים הידועים, וכן שני סוגים שאינם נפגעים ע"י ואשר שמשו כביקורות שליליות. שיטה זו אפשרה שימוש בכמויות שוות של גלאים וצמצמה אי-ודאויות שנבעו מחוסר האחידות שבין הגלאים שבספריית שבטי ה λ שתוארה לעיל. כמו כן הושגה יעילות היברידציה טובה יותר בשל העדר אפשרות של קיפול עצמי של הגלאי. שלישית, מיקומם של אתרי החיתוך בסובסטרט נקבע לפי זהותן של קבוצות הקצה ה 5 המסומן של תוצרי החיתוך. קבוצות אלה שוחררו ע"י עיכול בריבונוקלאז P1, כפי שתואר קודם. לבסוף, מידת פעילותם של המוטנטים הוערכה על סמך הכמות הכללית של תוצרי החיתוך. 3.2.1 פנוטיפ החיתוך של מוטציות בעמדה 287 יש לציין כי בכל המוטציות שנבדקו בעמדה זו, כמו באלו של עמדות 286 ו 288, נבקע הסובסטרט הטבעי trna Lys במקום הרגיל, כלומר מצד '5 של בסיס ה Wobble בדומה 41

לפנוטיפ הבר וזה של המוטציות משנות תבנית החיתוך D287Y ו.S288P מאידך, הסטה של אתר החיתוך נצפתה בסובסטרטים משניים דוגמת trna Glu בדומה למה שנמצא עבור המוטציות D287Y ו.S288P כך היה לגבי חמש מוטציות איגיון (missense) נוספות בעמדה 287 (טבלה 3.1) אך לא בחמש אחרות. מבין החמש הייתה D287Q בעלת הפעילות הגבוהה ביותר in vivo ובקעה במידה ניכרת סובסטרטים משניים שכללו את, Asn trna trna Glu ו-,tRNA Gln1 חלקם במורד לאתר הרגיל שכן המקטעים המסומנים הכילו את D287Q קבוצות הקצה U או C במקום U 8 או.Q לעומת זאת נבקע trna Gln2 ע"י כנראה בעמדה הרגילה. הפעילות הגבוהה של D287Q התבטאה גם בפנוטיפ טוקסי דומה לזה של גזע הבר (פחות מ 0.1% מהמושבות שורדות על.(IPTG מוטנט דומה ל D287Q הן ברמת תוצרי הביקוע והן ברעילות היה.D287H תבנית תוצרי הביקוע דמתה אף היא, אך העוצמה היחסית של התוצרים הייתה שונה. בעוד ש D287Q ביקע יחסית יותר trna Glu (תמונה 3.10, הפס השני מלמעלה בשני המוטנטים), D287H בקע יותר מ trna Gln2 (תמונה 3.10, הפס השלישי). כן היה ל D287H פס נוסף על אלו שהופיעו עם,D287Q בצמוד לפס הנמוך ביותר. trna Asn, trna Glu ו- trna Gln1 נבקעו גם כן ע"י D287H במורד לאתר הרגיל שכן תוצריהם שחררו אותן קבוצות קצה (U או C). בנוסף זוהה במקרה זה גם מקטע של.tRNA Arg הוא שחרר את קבוצת הקצה I, המעידה על חיתוך Arg(ICG) trna בעמדה הרגילה, וכן C המתקבל מחיתוך אותו סוג בהסטה של בסיס אחד. לחלופין יכול תוצר זה להתקבל מחיתוך Arg(CCG) trna או מחיתוך trna אחר שלא זוהה. מוטנט שלישי שפעל בדומה ל D287Q ול D287H היה.D287N גם במקרה זה הייתה כמות התוצרים גבוהה ובהתאם לכך נשמר הפנוטיפ הטוקסי של גזע הבר. תבנית התוצרים באלקטרופורזה היתה דומה לזו של שני המוטנטים הקודמים, יחס העוצמות בין הפסים היה דומה יותר לזה של,D287H אך ללא הפס הנוסף (תמונה 3.10). D287N בקע את אותם הסובסטרטים שבקע,D287H כאשר את trna Asn הוא חתך מחוץ לאתר הרגיל (קבוצת קצה 42

G, שמקורו לא ידוע ו C שחרר trna פרגמנט שזוהה בהיברידיזציה כמכיל בעיקר Gln1 U). היכול להתקבל מחיתוך trna Gln1 בהסטה של שני בסיסים. מוטנט מעניין נוסף היה.D287G מוטציה זו הותירה רמת פעילות בינונית והפנוטיפ הטוקסי הוחלש בהתאם (שרדו כ 1% מהמושבות שנזרעו על.(IPTG תבנית התוצרים באלקטרופורזה היתה דומה לזו של,D287N כאשר הפס המתאים ל trna Glu החתוך בהסטה של בסיס אחד מופיע, אך בעצמה נמוכה מאוד (תמונה 3.10, הפס השני). כל הסובסטרטים שנחתכו ע"י D287H ו D287N נחתכו גם כאן. נראה ש trna Asn נבקע מחוץ לאתר הרגיל (קבוצת קצה U). גם החילוף D287F גרם להסטת אתר החיתוך. מוטנט זה התנהג בדומה ל,D287Y אך פעילותו הייתה נמוכה הרבה יותר והוא איבד בהתאמה את הפנוטיפ הלתלי (עם D287Y שורדות רק 3% מהמושבות על.(IPTG בדומה ל D287Y הוא בקע trna Glu (קבוצת קצה U או C) ו trna Asn (קבוצת קצה U) מחוץ לאתר החיתוך הרגיל. לגבי יתר המוטציות בעמדה 287 לא ניתן לקבוע בברור אם הן גרמו לחיתוך שונה מהרגיל. למוטנט D287E היה פנוטיפ לתלי כמו לגזע הבר למרות שרמת החיתוך שהתקבלה הייתה נמוכה והוגבלה בעיקר ל.tRNA Lys למוטנט D287K היה פנוטיפ טוקסי מוחלש, בדומה ל,D287G ורמת פעילות בינונית שהצטמצמה בעיקר ל.tRNA Lys המוטנט D287S היה בעל רמת פעילות בינונית ובקע בעיקר,tRNA Lys במידה פחותה trna Glu trna Gln1 ו- ובמידה שיורית trna Asn, trna Arg ו-.tRNA Gln2 D287L היו בעלי פעילות נמוכה ביותר ואיבדו את הפנוטיפ הלתלי. D287V ו D287L בקע בעיקר,tRNA Lys וכן מעט trna Asn, trna Glu ו-.tRNA Arg בהתאם לכך, קבוצת הקצה העיקרית שהשתחררה מהפרגמנטים הייתה U, 8 אך נצפו גם כמויות קטנות יותר של C ו U ובספק Q. מכאן נראה שסובסטרטים חליפיים עשויים היו להבקע מחוץ לאתר 43

הרגיל. D287V בקע trna Lys ו.tRNA Glu מהפרגמנטים השתחרר בעיקר U 8 אך גם C שמקורו לא ברור. סיכום תוצאות אלה מעיד כי הזיקה לסובסטרט, הטבעי או המשניים, או יכולת ההפעלה שלהם תלויים בנוכחות שייר הידרופילי בעמדה 287. מבין שיירים אלה גרמו באופן בולט לשינוי הפנוטיפ - מבלי להחליש את הפעילות הכוללת - שלשה חילופים איזוסטריים שביטלו או הפכו את המטען:.D!Q,,N H שכמעט בטלו את הפעילות:.D!L,,V,I F בקצה השני ניצבים חילופים הידרופוביים מכאן נרמז שלשייר D287 זיקה ישירה לסובסטראט או לממס באמצעות קשרי מימן. 3.2.2 פנוטיפ החיתוך של מוטציות בעמדות 286,288 למוטנט S288H היה פנוטיפ לתלי דומה לגזע הבר. לעומת זאת, בהפרדה על ג'ל ברזולוציה גבוהה התקבלה תבנית חיתוך ייחודית שכללה ששה פסים, שונה הן מזו של גזע הבר והן מזו של מוטנטים אחרים (תמונה 3.10). trna Glu וכן trna Lys חתך בעיקר S288H ובמידה פחותה.tRNA Asn כן נמצאו כמויות קטנות של תוצרי חיתוך של trna Arg ו.tRNA Gln1 קבוצות הקצה שהשתחררו מתוצרי החיתוך כללו U U, 8 ו.G/I נראה שחלק מהסובסטרטים, כנראה trna Glu ו/או,tRNA Asn נבקעו במורד לאתר הרגיל. למוטנט S288F היה פנוטיפ לתלי מוחלש. הוא בקע בעיקר.tRNA Lys כמו כן הוא בקע מעט trna Glu ובמידה פחותה trna Arg ו.tRNA Gln1 תבנית התוצרים דמתה לזו של גזע הבר. המוטנט S288L איבד את הפנוטיפ הלתלי, רמז להחלשה ניכרת של הפעילות. בדיקה של חילופים נוספים בעמדה זו תאפשר להתרשם בצורה יסודית יותר מתפקידו האפשרי של S288 בהכרת הסובסטרט. שימר את הפנוטיפ הלתלי ותבנית תוצריו דמתה לזו של גזע הבר. לעומת המוטנט G286A זאת,.tRNA Glu ו trna Lys איבד את הפנוטיפ הלתלי ובקע G286N קבוצת הקצה של הפרגמנטים שהתקבלו עם שני מוטנטים אלה היו בעיקר U, 8 סימן לביקוע באתר הרגיל. לגבי G286D ניתן לומר לפי שעה רק שאבד את הפנוטיפ הלתלי. על סמך המידע 44

המצומצם שהתקבל נראה שאין ל G286 תפקיד בהכרת האנטיקודון, אם כי כדי לקבוע זאת בברור יש לבצע בדיקה מקפת הכוללת מספר חילופים נוספים. כיוון שמדובר בשייר גליצין, הוא עשוי לתחום מבנה שניוני הקשור בהכרת הסובסטרט מבלי להיות חלק ממנו. במקרה כזה עשויים חילופים דרסטיים לשנות במידה ניכרת את המבנה השניוני של שיירים סמוכים או להסיטם במידה ניכרת ממקומם ולהשפיע בכך בעקיפין על הכרת הסובסטרט ו/או דחיית סוגים שאינם מהווים סובסטרטים לאק"נ. PrrC Lethality Glu (U 8 UC) Asn (QUU) wt + U 8 Q D287Y - U U D287F - U U D287Q + U U D287H + U U D287N + לא נקבע U D287G - לא נקבע U מוטציות באתר הכרת הסובסטרט משנות את עמדת החיתוך בסובסטרטים משניים. טבלה : 3.1 הפרגמנטים הגדולים (ה `3) תוצרי ראקצית האק"נ סומנו בעזרת פולינוקלאוטיד קינאז (שיטות) בקצה ה `5, הופרדו באלקטרופורזה וסוג ה trna ממנו נבעו נקבע בעזרת הכלאה לאוליגונוקלאוטידים קומפלימנטרים על dot blots (שיטות). קבוצת הקצה (`5) המסומנת זוהתה ע"י עיכול בנוקלאז P1 והפרדה בכרומטוגרפיה דו-מימדית על שכבה דקה של צלולוז. מזהות קבוצת הקצה ניתן להסיק על מיקום עמדת החיתוך בלולאת האנטיקודון. נ של מוטנטים שונים בעמדות 287,288. מקטעי 3 שהתקבלו לאחר תוצרי חיתוך אק"נ תבנית תמונה 3.10: חיתוך ע"י אק"נ בתא וסומנו סימון קצה במבחנה (תמונה 3.5) הופרדו באלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילאמיד 22% (שיטות). המקטעים הנוספים על זה של trna Lys נובעים מביקוע סובטרטים משניים במקום הרגיל או במורד לו, כמפורט בטקסט. גם הפס המכיל את מקטע ה trna Lys מכיל במקצת המקרים תוצרים משניים. 45

אנליזת מוטציות של אזורי PrrC נוספים 3.3 האנליזה של PrrC בעזרת מוטגנזה אקראית הורחבה לחלקים נוספים של החלבון. סבב שני של מוטגנזה בוצע בדומה לראשון כאשר המקטע הנבדק מקודד לשיירים 156-396, כלומר כל החלק הקרבוקסילי וקרוב למחצית האזור האמיני של.PrrC בסבב זה נאספו 36 מוטנטי,missense מהם 5 שנשאו מוטציות כפולות. ארבע מוטציות יחידאיות חזרו פעמיים ואחת חזרה שלוש פעמים. בסה"כ נמצאו 25 מוטציות יחידאיות שונות. מעניין לציין ש 4 מתוכן החליפו שיירים שנפגעו בסבב המוטגנזה הראשון, עובדה המרמזת על התקרבות לרוויה של המוטגנזה. המוטציות שנמצאו התמפו בצברים. 5 מהן נמצאו בין שיירים 244-250 בצפיפות גדולה פי 7 מהממוצע. גדולה פי 3) ו 211-233 (פי 2). צברים נוספים הסתמנו בין שיירים 173-181 (צפיפות באשר לצבר המוטציות שזוהה בסבב המוטגנזה הראשון, הוא נמצא גם בסבב השני, אם כי בדלילות יחסית. שני שיירים ממנו נפגעו שוב (כולל הופעה חוזרת של (S288P ו 3 מוטציות נוספות נמצאו בסמיכות לו באזור הרחב יותר 281-311 (צפיפות פי 1.5 מהממוצע). ראוי לשים לב לעובדה כי בסבב המוטגנזה הראשון היו רק מחצית המוטציות בצבר זה בעלות פעילות אק"נ ניכרת ורק באחת לא התגלתה פעילות אק"נ כלל. בסבב השני נמצאה מוטציה אחת שהותירה פעילות נמוכה (S288P) ואחת מבטלת פעילות.(H295R) נראה אפוא כי ההתמקדות באזור מצומצם בסבב המוטגנזה הראשון אפשרה זיהוי אחוז גדול של מוטציות מותירות פעילות המאפיינות את אתר הכרות הסובסטרט, על רקע מיעוט מוטציות חסרות פעילות בעלות ערך סלקציה גבוה. מכאן נובעת מסקנה מעשית: למוטגנזה אקראית המבוצעת בקטעים מצומצמים של הגן יכול להיות יתרון על פני ביצוע המוטגנזה בכל הגן בו זמנית. דהיינו, מוטנטים בעלי פעילות חלקית ולכן רעילות חלקית וביניהם בעלי פנוטיפים ייחודיים דוגמת D287Y אולי לא היו מתגלים בפרוטוקול השני. באשר למוטנט הלא פעיל,H295R יש לציין שהחלפה אחרת של אותו שייר בסבב קודם (H295Y) הותירה פעילות. לכן אין להסיק מאובדן הפעילות של H295R כי שייר זה חיוני לפעילות האק"נ. 46

Mutation Frequen. ACNase a Mutation Frequen. ACNase a E173G 1 + F292S 1 Null F177S 1 ND H295Y 1 + V181G 1 ND H295R 2 Null F182C 1 ND K299E 1 ++ F206S 3 null E303G 1 ++ Y211S 1 ND A305P 1 ND P217H 1 ND V311A 3 ND S220F 1 ND L338P 1 ND D222E 1 ++ L339S 1 ND I227T 2(1+1) +++ V375G 1 ND L233P 1 ND L378S 1 ND S242P 4(3+1) null F388S 1 ND L244S 2 ND F388L 2 + K245E 2 null S170P, I237T 1 ND F246L 1 ND L186P,G396A 1 ND T249K 1 ND F213L, L236P 1 Null T250A 1 ND D215G,I227T 4 Null V258E 1 + L221F,T249P 1 ND L259P 4(3+1) null D223G,S293P 1 Null K266E 1 ++ D243N,L259P 1 ND Y269N 1 null F246L,Y269C 1 ND L281F 1 ++ I248T,F279L 2 ND L281P 1 ND L259P,A280V 1 ND D287Y 1 +++ b L259P,Q304L 1 ND S288P 2(1+1) + b K266R,L298P 1 Null.(156-396 (שיירים אק"ננננ תלויית סיכום המוטציות שנבררו בסלקציה לאבדן רעילות תלוי טבלה 3.2: a: +,++ ו +++ מציינים בהתאמה פחות מ 0.2-0.4 0.2, ויותר מ 0.4 מרמת פרגמנטי trna Lys של גזע הבר. b: מציין שינוי בפנוטיפ החיתוך. מספרים בסוגריים מציינים הופעה בסבבי מוטגנזה שונים. :ND אין נתונים. 47

סבב מוטגנזה שלישי התבצע כבדרך אגב במהלך שיבוט חלבון האיחוי MBP-PrrC (שיטות). איחוי( MBP ) Maltose binding protein לקצה האמיני של PrrC פגע בפעילות האק"נ.in vitro למרות זאת נותרה בחלבון האיחוי רעילות מספקת כדי להשרות סלקצית מוטנטים חסרי פעילות אק"נ. בסבב זה, שהקיף בעצם את כל הגן, נאספו 4 מוטציות יחידאיות. כולן התמפו לאזור שנבדק בסבב השני (156-396). כמו כן נמצא מוטנט כפול שפגע קרוב יותר לקצה האמיני, במוטיב ה.P-loop גם בסבב זה התמפו שתיים מהמוטציות לשיירים שהוחלפו בסבבים הקודמים. כאשר שולבו תוצאות שלושת סבבי המוטגנזה התקבלה תמונה שלמה יותר של פיזור המוטציות. בחלק זה של עבודתי בדקתי את האזור המשתרע משייר 156 עד לסוף החלבון. בסך הכל אספתי ואפיינתי 70 מוטנטי missense באזור זה, מהם 16 כפולים. חלק מהמוטציות חזרו (עד 4 פעמים) כך ש 54 המוטנטים היחידאיים ייצגו 38 מוטציות שונות. בנוסף לכך, בשלושה מקרים נמצאו חילופים שונים של אותו השייר, כך שבסה"כ נמצאו מוטציות יחידאיות ב 35 שיירים שונים במקטע באורך 241 חומצות אמינו (ראה טבלה 3.2). הופעתן החוזרת של חלק מהמוטציות, כמו גם הופעתם של חילופים שונים באותה עמדה מעידים על כך שחלק גדול ממרחב מהמוטציות האפשריות מוצה. מאידך, יש לזכור כי בשיטה שננקטה לא ניתן לקבל את כל החילופים האפשריים, אלא רק כאלה המתקבלים מחילוף של בסיס בודד. כמחצית מכלל המוטנטים נבדקו לפעילות אק"נ, ובכללם כל החילופים שפגעו בשיירים טעונים. רובן המכריע של המוטציות שנבררו נמצאו בחמישה צברים (תמונה 3.11). הצבר הראשון בין שיירים 173-182, חופף לקופסא הראשונה של ה DA box (ראה פרק הארגון הפונקציונלי של.(PrrC צבר שני בין שיירים 206-233, מכיל את הקופסא השניה של ה DA.(PrrC פרק הארגון הפונקציונלי של (ראה box הצבר השלישי נמצא בין שיירים. 242-250 בין שיירים 258-269 נמצא בספק צבר רביעי, והצבר האחרון, שזוהה כבר בסיבוב המוטגנזה הראשון, נמצא בין שיירים 281-311 (ראה פרק הארגון הפונקציונלי של.(PrrC 48

מתוך 35 השיירים השונים שעלו במוטגנזה, 31 היו בשיירים זהים בין PrrC להומולוג הקרוב שלו מ.N, meningitidis (ראה פרק 3.4 ותמונה 3.12). עוד 3 היו בשיירים שמורים (V ו L לעומת I), ורק במקרה אחד,,S242P שונה שייר שאינו שמור- ודווקא לשייר שנמצא באותה עמדה בהומולוג מ.N meningitidis (ראוי לציין כי ב Nme נמצא ה P בין שני שיירים בסיסיים, ואילו ה S נמצא בין שני שיירים חומציים). העובדה שהמוטציות היו בעיקרן בשיירים שמורים מהווה חיזוק לכך שהשיירים שנפגעו במוטגנזה אכן חשובים לפעילות האק"נ, וצברי המוטציות משקפים אזורים הקשורים לפעילות זו. 173-182 206-233 242-250 258-269 281-311 aa 155 200 300 396 יחידאיות בתחום השיירים 155-396. מספרים רומיים מציינים מספר פיזור מוטציות missense תמונה 3.11: חזרות של מוטציות בשייר. עיגולים מלאים מציינים את המוטציות השכנות ששינו את פנוטיפ החיתוך. מוטציות לפרולין סומנו באפור. מוטגנזה אקראית של תחילתו של הגן (שיירים 1-155) בוצעה ע"י רחל רוזנר אשר חקרה את תפקידם של האזור האמיני ושל מוטיב ה.P-loop כך כל PrrC נבחן במוטגנזה אקראית מלווה בסלקציה לאבדן רעילות תלוית אק"נ. גם בחלק זה של החלבון נמצאו המוטציות בצברים, כאשר כאן הסתמנו ארבעה צברים (1999.(Rozner, 49

3.4 זיהוי חלבונים הומולוגיים ל PrrC במאגרי נתונים בגנומים של שלושה מיני חיידקים: MC58, Neisseria meningitidis Acidithiobacillus ferrooxidans ו- Streptococcus equi שרצפיהם נקבעו לאחרונה נמצאו אתרים דמויי prr אשר כוללים את מסגרת הקריאה של PrrC משובצת בין מסגרות של מערכת רסטריקציה-מודיפיקציה מטיפוס.IC הומולוגיים ל PrrC במאגרי נתונים (שיטות). אתרים הומולוגיים אלה צצו בעקבות חיפוש בזן אחר של (Serogroup A) N. menigitidis נמצאה מערכת רסטריקציה-מודיפיקציה דומה לזו של הזן,(Serogroup (B MC58 אולם תחת PrrC נמצא בזן האחר מרווח בין-גני של 80 בסיסים. מצב דומה שורר ב-.E coli כאשר מערכת EcoprrI מצומדת ל PrrC ומערכת EcoR124I ההומולוגית המקודדת ע"י פלסמיד מטיפוס R מכילה גם היא במקומו מרווח בין גני דומה (תמונה 3.14). ברצפי שני המרווחים הבין-גניים של המערכות הללו אותרו קטעים פלינדרומיים, קשורים אולי ליכולת השיבוץ של prrc ע"י רקומבינציה באתר ייחודי זה. הקרבה בין prrc מ E. coli להומולוג מ.N meningitidis הייתה הגבוהה ביותר. הדימיון ברצף חומצות האמינו הוא של 73% והזהות בת 64% (תמונה 3.12). הדמיון הרב שבין IC מטיפוס Hsd להומולוגים שלו והתאחיזה הגנטית בין הומולוגים אלה לאתרי PrrC מרמזים על כך שמדובר באתרי אנטיקודון נוקלאזות ממוסכות ע"י זיקתן למערכות רסטריקציה-מודיפיקציה כנגד.DNA אולם אפשרות זו טעונה עדיין הוכחה. 3.4.1 העדר פעילות אק"נ נצפית של הומולוג PrrC מ-.N meningitidis המבוטא ב-.E coli הגן ההומולוגי ל prrc מ.N meningitidis MC58 צפוי לקודד לחלבון באורך של 380 חומצות אמינו (לעומת 396 ב.E) coli בעל מסה של 44.5. kda הגן, כולל אזור בקרת התרגום המשוער שלו, חולץ מ DNA כרומוזומלי של.N meningitidis MC58 ב PCR T7 RNA ושובט לפלסמיד SK תחת בקרת פרומוטור T7. הפלסמיד הוחדר ל.E coli מבטאי polymerase (שיטות). לאחר השריית הביטוי נבדקו התאים לפעילות אק"נ ולנוכחות 50

החלבון ב Western blot בעזרת נוגדנים מנוקים כנגד.E. coli PrrC בשני מבדקים שונים לפעילות אק"נ שנערכו (סימון ישיר של מקטעי trna בתא או סימונם in vitro לאחר בידודם מהתא) לא נמצאה פעילות כזאת למרות שהנוגדנים כנגד PrrC מ.E coli הגיבו עם שווה הערך מ.N meningitidis שנוצר בתא בכמות גדולה. אחד השבטים חסרי הפעילות נמצא בעל רצף DNA זהה לרצף גזע הבר (ראה שיטות), למעט מוטציה שקטה. לכן אין ליחס את העדר הפעילות למוטציה אלא, אולי, ליציבות מופחתת של החלבון החופשי אף במידה רבה מזו של PrrC מ.E. coli גם ביטוי ההומולוג מ.N meningitidis בנוכחות EcoprrI בתנאים מותאמים לשחזור אק"נ לטנטי לא הניבו פעילות זו (מיכל עמיצור תקשורת אישית). תוצאה זו עשויה להיות מוסברת בהבדלים בין רצפי צורות ה PrrC ומערכות ה Hsd התואמות המצמצמים את הסיכוי לזיקה הטרולוגית. השוואת רצפי חלבוני PrrC ההומולוגים מ.E coli ומ.N meningitidis חושפת שישה אזורים כמעט זהים (מעל 90% זהות ו 95% דימיון) באורכים של 14-21 חומצות אמינו. קיימים גם קטעים קצרים יותר בעלי הומולוגיה גבוהה (תמונה 3.12). חמישה מהאזורים השמורים הארוכים (וכן רצף שמור קצר אחד) חופפים לצברי מוטציות שנמצאו במוטגנזה האקראית. בשלושה מהם נמצאים מוטיבים מוכרים (ראה סעיף 3.5). לאור עובדות אלה נראה שלאזורים ההומולוגיים, כולל אלו שטרם נקשרה בהם פונקציה, חשיבות לתפקוד ו/או מבנה החלבון. זהות של 14 שיירים הכוללים את אתר הכרת הסובסטרט המשוער מרמזת כי לשני החלבונים עשויה להיות ספציפיות ביקוע דומה. 51

_P-loop_ * ** * * *** ****** 1 MGKTLSEIAQQLSTPQKVKKTVHKEVEATRAVPKVQLIYAFNGTGKTRLS 50 1 MGKSLTEIAEELKGNDK...KVQLIYAFNGTGKTRLS 34 ** ** * * * * * *** 51 RDFKQLLESKVHDGEGEDEAEQSALSRKKILYYNAFTEDLFYWDNDLQED 100 35 REFKNLIAPT..SSE.EPDGEP...TRRKFLYYNAFTEDLFFWDNDLLAN 78 *** * * 101 AEPKLKVQPNSYTNWLLTLLKDLGQDSNIVRYFQRYANDKLTPHFNPDFT 150 79 EAPRLKIQKNSFTDW...LLRDNGLDGAVIKNFQYYTDDKLTPDFNDDFS 125 DA box(i) * * * * ** 151 EITFSMERGNDERSAHIKLSKGEESNFIWSVFYTLLDQVVTILNVAD..P 198 126 EIAFYFARGNDEQIENIKISKGEESNFIWSIFYVLIRQVIAELNIPEDSE 175 DA box(ii) * * * * * * * * *** 199 DARETHAFDQLKYVFIDDPVSSLDDNHLIELAVNLAGLIKSSESDLKFII 248 176 EGRSTDQFDDLEYIFIDDPVSSLDENHLIQQAVDLADLIKLSKPRLKFII 225 binding ** ** * * * ** * 249 TTHSPIFYNVLFNEL...NGKVCYMLESFEDGTFALTEKYGDSNKSFSY 294 226 TTHNVLFYNVLYNELKKLEKEKKSYLLLKNEDGSFDILEKQGDSNKSFSY 275 * * * * * ** 295 HLHLKQTIEQAIADNNVERYHFTLLRNLYEKTASFLGYPKWSELLPDD.K 343 276 HLHLKGVIEKAIENQQVERFHFMLLRSLYEKTANFLGYKQRSDILPEDSR 325 * * * 344 QLYLSRIINFTSHSTLSNEAVAEPTPAEKATVKLLLDHLKNNCGFWQQEQ 393 326 RNYFQRIINFTSHSTLSNEAFAEPTPQEQETVKLLLQHLLDNYNFFQDDE 375 394 KNG 396 376 QRDKP 380 העליון) (הרצף נ מתמפות לרצפים שמורים בין הומולוגי PrrC מ.E coli אק"נ מוטציות תמונה 3.12: אזורים שמורים ארוכים (12< שיירים) מסומנים באדום בשני הרצפים. התחתון). וממממ N.meningitidis (הרצף אזורים שמורים קצרים יותר מסומנים באדום ברצף העליון בלבד. כוכביות מציינות מוטציות אקראיות שנבחרו על פי אובדן רעילות תלוית-אק"נ. המוטציות בתחום 1-155 נאספו ע"י רחל רוזנר (1999.(Rozner, 52

Multiple sequence alignment 3.4.2 החלבון ההומולוגי ל prrc מהחיידק.S equi הינו בעל אורך חזוי של 402 חומצות אמינו. דרגת השימור נמוכה יחסית: זהות של 34% ודימיון של 52% על פני 340 חוצות אמינו, כשקצה האמיני והקצה הקרבוקסילי אינם דומים. ניתן לזהות אזורים שמורים בין חלבון זה לשני ההומולוגים הקודמים. באורך 392 חומצות אמינו. הגן ההומולוגי מהחיידק.A ferrooxidans מקודד לחלבון צפוי זהו ההומולוג המרוחק ביותר מ :PrrC זהות של 31% ודימיון בקטע בן 370 חומצות אמינו. גם במקרה זה אין הומולוגיה בתחילת הגנים של 48% ובסופם. על רקע ההומולוגיה הכוללת הנמוכה יחסית, מתבלטים אזורים שמורים בין חלבון זה להומולוגים האחרים. השוואת הרצפים ההומולוגים חושפת חמישה אזורים השמורים בין כל הארבעה (תמונה שלושה מאזורים אלו כוללים את מוטיב ה P-loop ושתי קופסאות ה.DA box גם.(3.13 שני האזורים הנוספים, האחד באזור האמיני והשני ספק באזור האמיני ספק באזור הבא, התבלטו במידת שימור גבוהה בין ה.E coli וה.N meningitidis ועלו פעמים רבות במוטגנזה (תמונה 3.12). מכאן שלכל אחד מאזורים אלה צפויה להיות פונקציה - בפעילות אק"נ, בקישור ATP או בתפקיד אחר שטרם זוהה. מהאזור הכולל את אזור קישור הסובסטרט המשוער, הזהה לחלוטין בשני ההומולוגים הקרובים לאורך 14 שיירים, רק 4 שיירים נותרו זהים בכל ארבעת ההומולוגים. האזור המשומר האחרון בין שני ההומולוגים הקרובים אינו נשמר בין כל הארבעה. לאזורים שאינם שמורים בין ההומולוגים עשויים להיות תפקידים בפונקציות ייחודיות דוגמת אינטראקציות עם מערכת הרסטריקציה המתאימה. ראוי לציין כי כל האזורים השמורים בין ארבעת ההומולוגים נמצאים בשני השלישים הראשונים של החלבונים, בעוד שבשליש האחרון קיימים שיירים שמורים אך לא רצפים ארוכים שמורים. ייתכן כי העובדה האחרונה משקפת קיום אזור אמיני בעל תפקיד זהה בכל ההומולוגים ואזור (או אזורים) בחלק הקרבוקסילי בעלי תפקידים שונים. 53

_ P-loop_ Eco 1 MGKTLSEIAQ QLSTPQKVKK TVHKEVEATR..AVPKVQLI YAFNGTGKTR 48 Nme 1 MGKSLTEIAE ELKGNDK.........KVQLI YAFNGTGKTR 32 Seq 1 MGNDIKFENL EQISDNIIS......SNKKVHLL YAYNATGKTR 37 Afe 1 MKPGQPFADL PKLAAHLRG.... ELENKKAILL YAYNGTGKTR 39 Eco 49 LSRDFKQLLE SKVHDGEGED EAEQSALSRK KILYYNAFTE DLFYWDNDLQ 98 Nme 33 LSREFKNLIA PTSSE...EP DGEP...TRR KFLYYNAFTE DLFFWDNDLL 76 Seq 38 LSMELKNKVN ETDSDGN......SIK HILYFNSYTE DLFTWDNDLE 77 Afe 40 LSMAFKDI....GKQGDARD T.....LYFNAFTE DLFHWENDFE 74 Eco 99 EDAEPKLKVQ PNSYTNWLLT LLKDLGQDSN IVRYFQRYAN DKLTPHFNPD 148 Nme 77 ANEAPRLKIQ KNSFTDW... LLRDNGLDGA VIKNFQYYTD DKLTPDFNDD 123 Seq 78 NDEDRYLIYD KRTY...FGN FLEEQQLFER AVDNFQKYVG RSIDIEFQDV 124 Afe 75 GDNDHRLTL..NAASRFFAG.LAELEMDNR IRPLLQRYAD...FDFRID 117 DA box(i) Eco 149 FTEITFSM.....ERGNDE RSAH......IKL SKGEESNFIW 179 Nme 124 FSEIAFYF.....ARGNDE QIEN......IKI SKGEESNFIW 154 Seq 125 IETVKDEFGN VQKDNRGEAL TISNKKSIRF KVDGHT.IKV SRGEERIFVW 173 Afe 118 YEKWDVVFSR RVKNE..NYV PGSKKLMQRF AFEEKTHIKV SRGEENIFVW 165 DA box(ii) Eco 180 SVFYTLLDQV VTILNVAD.. PDARETHAFD QLKYVFIDDP VSSLDDNHLI 227 Nme 155 SIFYVLIRQV IAELNIPEDS EEGRSTDQFD DLEYILIDDP VSSLDENHLI 204 Seq 174 SVFLTLLEII I...EDL TESADTSEFS KMNYIYIDDP ISSLDDTNII 217 Afe 166 CFFLAIVQLA L....DGAEAYQW..VKYVYIDDP ISSLDEHNAI 203 Eco 228 ELAVNLAGLI KSSE.SDLKF IITTHSPIFY NVLFNEL......NGKVCYM 270 Nme 205 QQAVDLADLI KLSK.PRLKF IITTHNVLFY NVLYNELK.. KLEKEKKSYL 251 Seq 218 NAAIYLSDVI GSAENTDLKF VVSTHQALFY NVLYNEIRFD RRIKKKVFYV 267 Afe 204 AVANHLAQLL K.RPGSKLKT VISTHHTLFF NVLCNEFKGK AFR...YF 247 Eco 271 LESFED.....GTFALTEK YGDSNKSFSY HLHLKQTIEQ AIADNNVERY 314 Nme 252 LLKNED.....GSFDILEK QGDSNKSFSY HLHLKGVIEK AIENQQVERF 295 Seq 268 MKATDEIEDE KQFKYLLTDV EGDS..PFGY HLRVREELRK AIQDEQVEKF 315 Afe 248 L...RNA PTGSYSLVDT...SATPFLH HLASIIELDE AQKSGALYTH 288 Eco 315 HFTLLRNLYE KTASFLGYPK WSELL......PDD.K QLYLSRIINF 353 Nme 296 HFMLLRSLYE KTANFLGYKQ RSDIL......PEDSR RNYFQRIINF 335 Seq 316 HFALFRNLVE KTATFLGYGR WENILLGLDV AGHVITSENI KLY.TQLIDL 364 Afe 289 HFNMMRRVME QTSIFLGLED WAECIR......VAGDLD EALSKRMIDL 330 Eco 354 TSHSTLSNEA VAEPTPAEKA TVKLLLDHLK NNCGFWQQEQ KNG~~~~~~~ 396 Nme 336 TSHSTLSNEA FAEPTPQEQE TVKLLLQHLL DNYNFFQDDE QRDKP~~~~~ 380 Seq 365 YTHNRHADLE YRELPPQEKN TLINLFNSFD SIYRFKED~~ ~~~~~~~~~~ 402 Afe 331 MSHGDYSLYE PREMMEENKA HFRRIFRAFL NRYPFNPKLF PVAPEDDNVG 380 Eco ~~~~~~~~~~ ~~ Nme ~~~~~~~~~~ ~~ Seq ~~~~~~~~~~ ~~ Afe 380 EEPTLLQWGE NR 392 השוואת רצפי הומולוגי PrrC מ.S equi.n, meningitidis.e, coli ו-.A. ferrooxidans תמונה 3.13: שיירים זהים בכל ההומולוגים מסומנים באדום. שיירים שמורים בין כל ההומולוגים מסומנים בכחול. 54

3.4.3 השוואת רצף אתר prr בכללותו עם האתרים ההומולוגיים.E coli ההומולוגיה בין מערכת זו לאחותה מ.N: meningitidis MC58 מתקיימת הן בין הגנים והן בארגון האתר (תמונה 3.14). הגן המשוער הראשון באתר הוא,hsdM כמו ב.EcoprrI הגן ההומולוגי ל prrc נמצא 57 בסיסים לאחר סיומו הצפוי של גן ה hsds המשוער (ב EcoprrI 12 בסיסים). בסופו של PrrC ההומולוגי מתחיל ההומולוג של hsdr כמו במערכת,EcoprrI אך הן ב hsds והן ב hsdr של MC58 קיימים שינויים בהשוואה להומולוגים שלהם במערכות האחרות שיפורטו בהמשך. מלבד זאת קיים הבדל נוסף בין האתרים: לאתר מ.N meningitidis מסגרת קריאה נוספת בין הגן הראשון (hsdm) לגן ה hsd השני,(hsdS) שני גנים המהווים מסגרת שעתוק אחת במערכות המקבילות שב.E. coli מסגרת קריאה נוספת זו נמצאת גם במערכת המקבילה חסרת ה prrc מ,SerogroupA והיא מקודדת לחלבון תאורטי באורך 336 חומצות אמינו. בחיפוש בעזרת BLAST נמצא לגן הומולוג יחיד (67% דימיון) בעל פונקציה בלתי ידועה,,RhuM שאותר באי-פתוגניות.(Blanc-Potard et al., 1999) Salmonella enterica בחיידק (pathogenecity island) לגן hsds של.N meningitidis-mc58 יש קודון טרמינציה לאחר חומצה אמינית 162, בתחילת אזור המרכב מ 3 חזרות של הטטרפפטיד.Thr-Glu-Leu-Ala טטרפפטידים חוזרניים יוצרים בחלבוני HsdS את המרווח המפריד בין שני האזורים המכירים את שתי תיבות רצף ה DNA הייחודיות של אתר ההכרות. הוספה או גריעה של טטרפפטיד כזה משנה את גודל המרווח בין שתי התיבות באתר ההכרות בבסיס אחד (1989 al.,.(price et הופעת קודון טרמינציה באתר זה רומזת על אפשרות ביטוי חליפית בה נוצר פפטיד חלקי של ה hsds ששני פרוטומרים שלו מכירים פלינדרום, במקום הרצף האסימטרי בן שתי התיבות השונות המופרדות ע"י מרווח אשר מוכר ע"י מסגרת הקריאה השלמה. תופעה כזו נצפתה כאשר הוכנס במכוון קודון טרמינציה לגן ה hsds של המערכת ההומולוגית.(Abadjieva et al., (1993 EcoR124I לאחר קודון הטרמינציה הנדון נמשך רצף המשלים מסגרת קריאה בת 390 חומצות אמינו, גדול דומה לחלבוני hsds מוכרים. הקריאה כולה משועתקת בעקבות סופרסיה של קודון הטרמינציה הפנימי. יתכן כי מסגרת שינויים כאלה 55

עשויים להוות מנגנון לביטוי סירוגי של חלבוני hsds שונים המקנים ספציפיות לאתרי הכרות שונים ב.DNA בגן hsdr של.N meningitidis-mc58 נמצא מחדר באורך 1081 bp המכיל גן משוער של טרנספוזז באורך 321 חומצות אמינו. הטרנספוזז המשוער נמצא באורינטציה הפוכה ל hsdr בין שיירים 116 ו 117. ברצפים האופפים את המחדר קיימת זהות של כ 98% ברמת חומצות האמינו בין הגן שב.N meningitidis-mc58 למקבילו מה.N. meningitidis-serogroupa כ 15 bp מסוף המחדר נמצא קודון,Met כך שיתכן שיש תרגום של חלק הגן הנמצא לאחר המחדר, ובמקרה כזה חסר החלבון את 116 השיירים הראשונים..S: equi גם במקרה זה נשמר סדר הגנים באתר (תמונה 3.14). מעניין לציין כי כפי שנמצא ב.N meningitidis-mc58 גם כאן יש קודון טרמינציה בתוך מסגרת הקריאה של הגן המשוער של,hsdS כאשר במקרה זה ישנה גם הכפלה של חלק מהגן. כך נמצאים רצפים המתאימים עפ"י הומולוגיה לרצפי hsds במקטע באורך 1872 אשר בהתעלם מקודוני טרמינציה "פנימיים" יכול לקודד ל 623 חומצות אמינו. בתוך הרצף הזה נמצאים שני קודוני הטרמינציה: לאחר 315 חומצות אמינו ולאחר 447 חומצות אמינו..A: ferrooxidans זהו ההומולוג המרוחק ביותר מ PrrC גם בארגון האתר. לחיידק זה יש אמנם שלושה גנים הומולוגיים למערכת ה,hsd אך הם מפוזרים על פני כ 13. Kb גם הסדר של הגנים שונה: hsdr המשוער מופיע ראשון, אחריו ההומולוג של,hsdS אחריו מרווח בו נמצאת מסגרת קריאה נוספת המקודדת לחלבון תיאורטי אשר עשוי עפ"י הומולוגיה להיות הליקאז. בהמשך נמצא הגן ההומולוגי ל PrrC ומיד אחריו ה hsdm המשוער (תמונה 3.14). 56

prrc נטולי מטפוס IC רסטריקציה-מודיפיקציה עם אתרים שווי ערך או אתרי רסטריקציה prr אתר השוואת תמונה 3.14: משני גזעי.N, meningitidis מ-.S equi ומממ-מ.A. ferrooxidans של.E, coli מפלסמיד R 57

ב( 3.5 הארגון הפונקציונלי של PrrC 3.5.1 מוטיב DA box-like קיומו של אזור בעל תכולת G+C נמוכה באזור הרבע השלישי של הגן, יחד עם המצאותו של מוטיב ה P-loop בחלק האמיני של הגן הובילו להשערה כי חלקו האמיני של PrrC מהווה אזור נפרד קושר נוקלאוטיד (ראה פרק המבוא). בעבודה זו נמצא מוטיב נוסף המאפיין אזורים קושרי,ATP מוטיב.(Hirano et al., 1995) DA box-like המוטיב אותר בעזרת השרת ProfileScan (ראה שיטות). על פי התוכנה משתרע המוטיב באזור 169-251. מוטיב זה מופיע בחלבונים בהם יש מוטיב,P-loop ללא המוטיבים הנוספים המצטרפים אליו במקרים אחרים. ב DA box שתי "קופסאות". הראשונה מורכבת מחמישה שיירים, כאשר השני והרביעי הינם שמורים ביותר. רצף הקונצנזוס הוא.LSGGQ/E בעמדה הראשונה נצפו גם A ו C. בעמדה השלישית נצפו בנוסף ל G גם R,A ו H. בעמדה החמישית נרשמו גם H ו W. ב PrrC נמצא הרצף.LSKGE הקופסא השנייה מורכבת מארבעה שיירים הידרופוביים ולאחריהם DE (נצפה גם,(DD רווח של ארבעה שיירים DA box המרווח מורכב מהרצף,XDAA ב DA box-like המרווח אינו מכיל רצף מוגדר), ולאחר מכן.LD ב PrrC נמצא הרצף.YVFIDDPVSSLD המרחק שדווח בין שתי הקופסאות הוא 15-24 שיירים. ב PrrC המרחק הוא 37 שיירים. מוטיב ה,DA box-like כמו גם מוטיב ה,P-loop שמור בין כל ארבעת ההומולוגים של,PrrC אם כי קיימים הבדלים קלים. בקופסא הראשונה השייר הראשון ב Nme הוא I במקום L, ובשני ההומולוגים האחרים יש V באותה עמדה. כן יש לשני האחרונים R במקום K בעמדה השלישית (ראה תמונה 3.13). קיומו של מוטיב ה DA box-like (להלן: מוטיב ה (DA box מחזק את ההשערה בדבר קיומו של אזור קושר נוקלאוטיד בחלק האמיני של,PrrC מצביע על האזור כקושר ATP ומרחיב את גבולותיו עד לחומצה אמינית 250 לכל הפחות. 58

3.5.2 התפלגות אחוז ה G+C בגן prrc בחינת הרכב הנוקלאוטידים לאורכו של הגן prrc מגלה כי בחלקו הקרבוקסילי קיים אזור בו תכולת ה G+C נמוכה במידה נכרת מזו של שאר הרצף (אחוז G+C כולל: 45%). גבולות האזור, וכתוצאה מכך אחוז ה G+C שלו, אינם ניתנים לקביעה מדויקת שכן השינוי בהרכב הנוקלאוטידים הוא הדרגתי. ניתן לתחם את האזור לחומצות אמינו 245-290 G+C אחוז אך ניתן לכלול בו גם את הקטע 290-320 (בו.(%GC=39%,(%GC=34%) שונה עשוי לרמוז על מוצא גנטי שונה ומכאן על מבנה מרחבי עצמאי (Domain) (1996 Lawrence,.(Ochman and אתר קישור הסובסטרט המשוער נמצא על גבול האזור הזה. מעניין כי הרכב חומצות האמינו באתר הקישור מכתיב אחוז G+C נמוך (25%) בעמדות הקשיחות, בעוד שבעמדות הגמישות יש אחוז G+C גבוה (67%). כשנבדק הרכב הנוקלאוטידים של הגן ההומולוגי.N, meningitidis-prrc נמצא בחלקו הקרבוקסילי אזור בעל תכולת G+C נמוכה בהשוואה לשאר הגן המשתרע בקרוב בין חומצות אמינו 220-287 בו.%GC=24% אחוז ה G+C הממוצע בגן הוא 33%. כאשר משווים את האזור בעל אחוז ה G+C הנמוך בין שני החלבונים על פי ההומולוגיה ביניהם מסתבר כי האזורים הללו חופפים (ראה טבלה 3.3). כשבוחנים את הרכב הבסיסים של אתר קישור הסובסטרט המשוער (המשומר בין שני ההומולוגים) מסתבר שבהומולוג מ.N meningitidis נשמר אחוז ה G+C הנמוך (25%) גם בעמדות הגמישות. שני הגנים ההומולוגים הנוספים רחוקים יותר מ.E. coli-prrc אחוז ה G+C בהומולוג מ Streptococcus equi הוא.30% למרות ההומולוגיה הנמוכה יחסית, במיוחד בחלק הקרבוקסילי של החלבון, ניתן למצוא גם בהומולוג זה מקטע בעל אחוז ה G+C נמוך במקצת (26%) משל האזורים השכנים. האזור הזה קצר יחסית (חומצות אמינו 233-267) והוא שונה באחוז ה G+C רק במידה מעטה משאר הגן, אך בהשוואה להומולוגים הקודמים שוב נמצאת חפיפה בין האזורים. ההומולוג האחרון, מ,Acidithiobacillus ferrooxidans בעל אחוז G+C גבוה מהאחרים: 51%, ולא נמצא בו אזור בעל אחוז G+C חריג. 59

Homologue %GC Low GC domain Total Low GC domain (E. coli sequence) Eco 45% 34%(37%) 245-290(320) Nme 33% 24% 243-306 טבלה שלהם. הנמוך ה G+C ואזורי N. meningitidis ומ של הומולוגי prrc מ.E coli אחוז ה G+C 3.3: המצאות מקטעים מקבילים בעלי אחוז G+C נמוך בחלבונים הומולוגיים תומכת בהשערה כי החריגה בתכולת הנולאוטידים הינה משמעותית, ולפיכך מתחזקת הסברה כי יש ב PrrC אזור עצמאי החופף למקטע הגן בעל אחוז ה G+C הנמוך. מכאן שבחלבון שלושה אזורים מבניים (תמונה 3.15). האזור האמיני מהווה כ 60% מהחלבון וכולל שני מוטיבים המצביעים עליו כ,ATPase האזור האמצעי מקודד ע"י מקטע בעל אחוז G+C נמוך, משתרע עד מעבר לשייר ה 300 וכולל את אתר קישור הסובסטרט, והאזור הקרבוקסילי משתרע על כ 90 חומצות האמינו האחרונות של החלבון ותפקידו עדיין טעון ברור. פונקציונלי משוער של.PrrC אזור קישר ה ATP המשוער משתרע על כ 250 השיירים ארגון תמונה 3.15: הראשונים. האזור המקודד ע"י מקטע הגן בעל אחוז ה G+C הנמוך כולל את אתר קישור הסובסטרט. 3.5.3 השוואת הרצפים ההומולוגים מציעה קיום אלמנט ב PrrC החורג מהמבנה היסודי מהשוואת רצפי ההומולוגים מ.E coli ומ.N meningitidis עולה כי בין קטע דומה בן 12 E. coli שיירים בקצה האמיני לאזור שמור במורד הרצף (אזור ה (P-loop מצוי בהומולוג מ קטע ייחודי בן 21 שיירים (שיירים 13-33, תמונה 3.12) היוצר α הליקס על פי התחזית 60

(תמונה 3.16) - בעוד שב Nme נמצא במקביל קטע שונה ברצף ובן 5 שיירים בלבד. מכאן שהרצף הייחודי של.E coli מהווה כנראה אלמנט מבני שניוני החורג מהקיפול היסודי של החלבון האמור להיות משותף לשני ההומולוגים. יתר על כן, הרצף החריג עשיר בשיירים הידרופיליים, כאשר בין ארבע קבוצות כאלה חוצצים שלשה שיירי ולין היכולים להתוות צד הידרופובי הפונה כלפי גוף החלבון כאשר עיקר האלמנט חשוף לממס. ראוי לציין גם כי ברצף זה לא אותרה אף מוטציה שפגעה בפעילות האק"נ. באם רצף זה אכן חורג מהמבנה הבסיסי של החלבון, הוא עשוי להוות אתר מועדף לקישור חלבוני איחוי. 10 20 30 40 50 60 70 MGKTLSEIAQQLSTPQKVKKTVHKEVEATRAVPKVQLIYAFNGTGKTRLSRDFKQLLESKVHDGEGEDEA cccccchhhhhhccchhhhhhhhhhhhhhhhceeeeeeeeccccccchhhhhhhhhhhhccccccchhhh EQSALSRKKILYYNAFTEDLFYWDNDLQEDAEPKLKVQPNSYTNWLLTLLKDLGQDSNIVRYFQRYANDK hhhhhhhhhhhhhcceeeceeecccccccchhhheeecccccchhhhhhhhhcccccchhhhhhhhcccc LTPHFNPDFTEITFSMERGNDERSAHIKLSKGEESNFIWSVFYTLLDQVVTILNVADPDARETHAFDQLK cccccccccceeeeccccccchhhhhhhhccccccceeeeeeeecccceeeeecccccccchhhhhhhhh YVFIDDPVSSLDDNHLIELAVNLAGLIKSSESDLKFIITTHSPIFYNVLFNELNGKVCYMLESFEDGTFA eeeecccccccchhhhhhhhhhhhhhhcccccceeeeeecccccceeeeeceeccceeeeeeccccchhh LTEKYGDSNKSFSYHLHLKQTIEQAIADNNVERYHFTLLRNLYEKTASFLGYPKWSELLPDDKQLYLSRI hhhcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhccchhhhhhhhhhhhhhcceeeecccccccccccchhhhhhee INFTSHSTLSNEAVAEPTPAEKATVKLLLDHLKNNCGFWQQEQKNG eeecccccccccccccccchhhhhhhhhhhccccccceeceeeeec מבנה שניוני משוער של PrrC מ.E coli (עפפפ""""פ תמונה 3.16: e גדיל β ו- c סליל אקראי. שיטות). י התוכנה,GOR IV h מציין α הליקס, 61

3.6 חקרית המבנה הרביעוני של PrrC בעזרת צילוב חלבון חלבון הקושי לבטא ביתר את PrrC וחוסר יציבותו מקשים על ניקויו. אחת מתוצאותיה של המוטגנזה של PrrC היא גילוי מוטציות מחלישות פעילות שהצטברו בתאים בכמויות גדולות (תמונה 3.2). שתי מוטציות כאלה נמצאו בעלות פעילות in vitro גבוהה משמעותית מזו של גזע הבר (תמונה 3.4). נראה שריכוזו הגבוה של החלבון תורם ליציבות באופן המפצה על הירידה ברמת הפעילות האינטרינזית. מוטנטים נקודתיים כאלה עשויים להקל על חקירת האנזים,in vitro על כן התמקדתי בחקר החלבון המוטנטי D222E ששמש בהמשך גם חוקרים אחרים במעבדה בניסויי טיהור ואפיון החלבון. במצבו הטבעי מצוי PrrC באינטראקציה עם.EcoprrI אנזים רסטריקציה דומה,,EcoR124I קיים כקומפלקס. HsdM 2 R 2 S 1 תצמיד זה מכיל תת יחידה לזיהוי רצף,(HsdS) DNA שתי עותקי תת יחידת המתילאז (HsdM) ושני עותקים של תת יחידת הנוקלאז.(HsdR) סביר להניח שגם EcoprrI בנוי כך. קיימים הבדלי רצף מסוימים בין תת היחידה HsdR של EcoprrI המגיב עם PrrC ומקבילתה מ EcoR124I שאינו מגיב. הבדל זה מצביע על אתר HsdR- בתת יחידה זו של.PrrC העשוי להגיב עם EcoprrI כיוון ששני עותקים של EcoprrI מצויים בתצמיד, ייתכן כי גם PrrC נמצא כדימר או אוליגומר גבוהה יותר. בכדי לבחון אפשרות זו בחנתי אם PrrC הוא בר צילוב חלבון-חלבון. לשם כך הדגרתי תמציות S150 מהגזע K-38:pGP1-2:pRRC11-D222E אשר מבטא את החלבון המוטנטי, בריכוז נמוך (0.01%) של גלוטראלדהיד המתאים לצילוב תוך-מולקולרי. ההדגרות בוצעו בטמפרטורת החדר או ב 0 C ובמהלך ההדגרה נלקחו דגימות והחלבונים הופרדו ב SDS-PAGE ונבדקו ב Western עם נוגדנים מנוקים כנגד.PrrC לאחר דקה של הדגרה נחלש פס החלבון המקורי והופיעו פס חדש בן 90 kda לכאורה וכן פסים גבוהים יותר, מתאימים במיקומם להומוטרימר והומוטטראמר. האחרונים התחזקו במשך ההדגרה (תמונה 3.17). למרות ההתאמה בגודל לא ניתן לדחות עדיין את האפשרות שמדובר בתוצרי צילוב בין PrrC לחלבון אחר בתמצית הגלמית. 62

ע( יוצר אוליגומרים. :3.17 PrrC תמונה תמציות S150 מהגזע K-38:pGP1-2:pRRC11-D222E הודגרו עם גלוטראלדהיד בריכוז נמוך (0.01%). ההדגרות בוצעו בטמפרטורת החדר (ערוצים 2-4) או ב 0 C רוצים 5-8). החלבונים הופרדו ב SDS-PAGE וזוהו ב Western blot ע"י נוגדן שנוצר כנגד חלבון קטוע PrrC 50-396 ונוקה ע"ג האנטיגן. 63